全反式维甲酸对卵巢癌SKOV3细胞增殖、分化的影响

张海娟，杨玉秀

(石家庄市第四医院，石家庄050017)

自1971年Friend等发现二甲基亚砜可诱导小鼠红白血病细胞分化为成熟红细胞而产生血红蛋白以来，诱导分化作为一种治疗恶性肿瘤的有效方法引起了人们的重视。维甲酸类化合物是常用的诱导分化剂，对多种恶性肿瘤具有诱导分化、抑制增殖、诱导肿瘤细胞凋亡的作用［1］。全反式维甲酸(ATRA)是维生素A的天然衍生物及生物活性形式，能诱导多种肿瘤细胞分化或抑制肿瘤细胞增殖［2］。为探讨ATRA对卵巢癌SKOV3细胞的抑制增殖和诱导分化作用，2009年1～12月，我们进行了相关研究。现报告如下。

1 材料与方法

1.1 材料 卵巢癌SKOV3细胞株购自北京大学人民医院。RPMI-1640培养基购自GIBCO BRL公司;MTT购自Singma公司。鼠抗人分化相关基因1(NDRG1)单克隆抗体购自DBS公司;SP试剂盒和DAB显色剂购自北京中山生物公司。ATRA购自Sigma公司;酶标仪购自Absystems Dragon公司;流式细胞分析仪购自BD Facscalibur公司。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养 以1×10－6mol/L的ATRA处理人卵巢癌 SKOV3细胞 1、2、3、5 d为实验组，不加ATRA处理细胞为对照组。将SKOV3细胞置于RPMI-1640培养基中，加入10%的新生牛血清、100 U/mL青霉素和0.1 mg/mL链霉素。细胞培养用50 mL培养瓶，在5%CO2、37℃饱和湿度的温箱中培养，细胞生长达汇合状态时，用0.04%EDTA消化后传代。

1.2.2 细胞增殖抑制率测定 采用MTT比色法。取对数生长期细胞，消化后加培养液吹打均匀，以1×105/mL细胞密度接种于96孔培养板，每孔加入100 μL细胞悬液，24 h后加入ATRA储存液，并用RPMI-1640培养液调终浓度为1×10－6mol/L。实验组每组设6复孔，24 h更换培养液，分别将ATRA作用1、2、3、5 d后的细胞进行测定，向每孔培养液中加入5 mg/mL的MTT 20 μL，小心吸去上清，4 h后每孔加150 μL DMSO液终止反应，用酶标仪测490 nm波长的吸光度(A值)，计算细胞增殖抑制率。同时设空白对照孔。

1.2.3 细胞周期分布检测 收集两组悬浮细胞和贴壁细胞，细胞数不低于1×106个，离心后弃上清，用冷PBS漂洗，冷乙醇固定，在4℃冰箱中过夜。次日离心弃乙醇，用PBS漂洗后，上流式细胞仪进行细胞周期检测。

1.2.4 SKOV3细胞中的NDRG1蛋白表达检测采用免疫组化SP法。取两组细胞爬片标本，严格按照试剂盒说明检测两组NDRG1蛋白表达。用冷丙酮固定，PBS冲洗，1%的Triton修复暴露抗原，10%山羊血清封闭非特异性结合位点;滴加适当稀释的一抗，置37℃温箱孵育2 h或4℃冰箱过夜，依次滴加二抗、三抗，行DAB显色、苏木精复染、梯度乙醇脱水、二甲苯透明、中性树胶封片。在倒置显微镜下观察两组细胞形态变化，NDRG1蛋白表达阳性着色呈棕黄色或黄色颗粒，位于细胞质及细胞核周围。每组随机选取30个视野，用双评分半定量法评分:①按阳性细胞百分率计分:阳性细胞百分率≤5%计0分，6% ～25%记1分，26% ～50%计2分，51% ～75%计3分，＞75%计4分。②按染色强度计分:无着色计0分，淡棕黄色或黄色计1分，棕黄色或黄色计2分。两项合并得0分为阴性(－)，1～2分为弱阳性(+)，3～4分为阳性(++)，5～6分为强阳性(+++)。

1.2.5 统计学方法 采用SPSS10.0统计软件，计量资料用±s表示，组间比较用t检验;计数资料用百分比表示，组间比较用χ2检验。P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ATRA作用不同时间点的A值比较 见表1。实验组各时间点的A值均明显低于对照组(P均＜0.05);实验组 ATRA 作用后1、2、3、5 d，其细胞增殖抑制率分别为 16.7%、20.9%、23.1%、28.6%，两两比较P均＜0.05。

表1 两组ATRA作用不同时间点的A值比较(±s)

表1 两组ATRA作用不同时间点的A值比较(±s)

注:与对照组比较，*P ＜0.05

组别ATRA作用后A值1 d 2 d 3 d 5 d对照组0.30 ±0.08 0.48 ±0.05 0.52 ±0.02 0.63 ±0.09实验组 0.25 ±0.03*0.38 ±0.06*0.40 ±0.09*0.45 ±0.04*

2.2 两组细胞周期比较 对照组细胞周期为G1/G0期(50.1 ±0.9)%、S期(28.4 ±0.25)%;实验组1、2、3、5 d 的 G1/G0期细胞分别为 (58.2 ±0.38)%、(62.9 ±0.32)%、(65.4 ±0.12)%、(68.9±0.41)%，S 期细胞分别为(25.1 ±0.49)%、(22.9±0.33)%、(21.0 ±0.51)%、(19.2 ±0.18)%。与对照组比较，实验组G1/G0期细胞增多，S期细胞减少(P 均＜0.05)。

2.3 两组NDRG1蛋白表达比较 见表2。

表2 两组NDRG1蛋白表达比较

2.4 细胞形态变化 倒置显微镜下，对照组细胞大小均匀，贴壁生长。实验组细胞生长缓慢，数量减少，细胞大小不一，形态不规则，贴壁能力减弱，细胞膜绒毛减少，细胞核光滑无切迹，分裂像少见，凋亡细胞较多。

3 讨论

诱导分化是指恶性肿瘤细胞在体外分化诱导剂作用下，向正常或接近正常细胞方向分化逆转的现象。维甲类化合物具有较好的诱导分化和增殖抑制作用，其主要通过诱导核维甲酸受体表达起作用，同时抑制异常角化，调节癌基因和抑癌基因表达［3，4］，其代表药物是ATRA。研究表明，ATRA能诱导多种肿瘤细胞分化或抑制肿瘤细胞增殖。上世纪80年代王振义等［5］首先用ATRA治疗急性早幼粒细胞白血病，取得较高的缓解率。本研究发现，ATRA可抑制SKOV3细胞生长，且随时间延长其抑制作用明显，提示ATRA有较强的抑制癌细胞增殖和诱导其分化作用。

有研究表明，细胞周期长短主要决定于G1期，G1期阻滞可使细胞周期延长，导致细胞增殖减慢，Inui等［6］研究表明ATRA可影响细胞DNA的合成，改变细胞周期和信号传导途径，使细胞在G1期前停滞。本研究显示，ATRA作用于SKOV3细胞后，G1/G0期细胞增多，S期细胞减少，说明ATRA能阻止细胞由G1/G0期向S期转化，延长细胞分裂周期，抑制细胞增殖，与骆霞岗等［7］在研究ATRA对人胰腺癌细胞PC-3诱导分化作用中的结论相同。本研究还发现，ATRA处理后的细胞在形态学上出现了良性分化表现，即细胞增殖受抑制，细胞数量减少，细胞贴壁能力减弱，细胞膜绒毛减少，细胞核分裂像少见，凋亡细胞较多，与张强等［8，9］观察 ATRA 对人骨肉瘤细胞影响的结果相似。

NDRG1基因是新发现的与细胞分化有关的基因，广泛存在于人体各组织中，在其生长过程中起重要作用。Kurdistani等［10］发现，NDRG1基因在乳腺癌、前列腺癌细胞株及肿瘤组织中呈低表达，其过表达可抑制肿瘤细胞生长。研究表明，NDRG1可被多种分化调节剂诱导表达，如缺氧及镍化合物、维甲酸、维生素 D3等可使其 mRNA或蛋白表达上调［11，12］。1999 年 Piquemal等［13］曾报道用多种分化诱导剂处理白血病细胞株U937，发现NDRG1蛋白表达出现上调。本研究发现，ATRA作用于SKOV3细胞后，NDRG1蛋白表达高于对照组，提示ATRA有诱导NDRG1表达的作用，表明NDRG1参与了卵巢癌细胞的诱导分化，维甲酸可能通过调节其表达而促进细胞分化、抑制细胞增殖。

综上所述，ATRA有抑制卵巢癌细胞增殖、诱导其分化的作用，将诱导分化治疗作为卵巢癌的综合治疗方法具有现实意义。

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