葵花籽粕蛋白质提取工艺参数优化

加列西·马那甫，景伟文，吐力吾汗·阿米汗

（新疆农业大学化学工程学院，新疆乌鲁木齐830052）

葵花籽是资源丰富的油料作物和经济作物，葵花籽粕是油脂加工业的主要副产品，蛋白质含量达29%～43%，绿原酸含量达1.1%～4.5%，是未能充分利用的植物蛋白质来源，通常作为低廉的动物饲料使用。从葵花籽粕中提取蛋白质时，绿原酸很容易被氧化成绿色的醌，使蛋白质呈深褐色或棕褐色，与蛋白质分子反应生成非反刍动物无法消化的非营养成分，从而降低蛋白质的营养价值和功能性质。在20%～80%的有机溶剂中溶解度很小，因而乙醇提取绿原酸的过程中蛋白质损失很少[1-3]。

目前葵花籽粕蛋白质的提取工艺研究，以正交试验方法确定其最佳工艺条件为主，未见响应面法优化提取工艺的报道[4-7]。虽然正交试验方法能够同时考虑几种影响因素，寻找最佳因素水平组合，却不能找出因素与响应值间的确切函数表达式，即回归模型，从而无法找到全部影响因素的最佳组合和响应值的最优值。本实验以葵花籽粕为原料，采用乙醇浸提法脱除葵花籽粕中的绿原酸，盐提法提取蛋白质，应用响应面法[8-11]优化蛋白质的提取工艺，通过实验建立各影响因素与蛋白质提取率的数学模型，获得最优的生产工艺参数，为葵花籽粕的工业化生产提供参考和借鉴。

1 仪器、材料与试剂

1.1 材料与试剂

材料：葵花籽粕，新疆兽药饲料监察所提供。

试剂：乙醚、无水乙醇、硫酸、硫酸铜、硫酸钾、氢氧化钠、对硝基酚、乙酸、乙酸钠、甲醇、乙酰丙酮、硫酸铵均为分析纯；实验用水均为超纯水。

1.2 仪器

TU-1810型紫外-可见分光光度计：北京普析通用仪器有限责任公司；AL204-IC电子分析天平：梅特勒-托利多仪器有限公司；WC/09-05恒温水浴槽：上海苏进仪器设备厂；pHS-3C型酸度计：上海精密科学仪器有限公司雷磁仪器厂；DHG-9055A型电热鼓风干燥箱：上海一恒科学仪器有限公司。

1.3 方法

1.3.1 葵花籽粕蛋白质的提取

称取干燥，过40目标准筛的葵花籽珀粉末，脱脂，脱绿原酸（料液比1∶14、55%乙醇、60℃和pH为6的实验条件提取1.5 h），在40℃干燥恒重，精称约3 g，加1.5 mol/LNaCl溶液，60℃和pH为8条件下提取1.5 h，过滤，残渣用1.5 mol/L NaCl溶液洗涤数次，滤液和洗液用水稀释至100 mL容量瓶中，即为待测葵花籽粕蛋白质的提取液。

1.3.2 葵花籽粕蛋白质含量与提取率的测定

含量与提取率的测定：蛋白质含量测定采用GB/T5009.5-2003（方法二）。

1.3.3 单因素试验方法

以葵花籽粕为原料，利用盐提法研究NaCl浓度、提取温度和液料比对葵花籽粕蛋白质提取率的影响。

1.3.4 响应面法优化葵花籽粕蛋白质的提取条件

综合单因素实验结果，根据Box-Benhnken中心组合实验设计原理，采用响应面法，在三因素三水平上对葵花籽粕蛋白质的提取工艺进行优化研究。

2 结果与分析

2.1 单因素对葵花籽粕蛋白质提取率的影响

2.1.1 NaCl浓度对葵花籽粕蛋白质提取率的影响

在相同实验条件下，分别用 0.5、1.0、1.5、2.0、2.5和3 mol/L的NaCl溶液提取蛋白质，考察不同浓度的NaCl溶液对葵花籽粕蛋白质提取率的影响，结果如图1所示。

图1 NaCL浓度对蛋白质提取率的影响Fig.1 Effect of NaCl concentration of extraction on LBPP yield

由图1可知，随着NaCl浓度的增大，蛋白质的提取率也逐渐增大。当NaCl浓度为1.5 mol/L时，蛋白质的提取率最高。当NaCl浓度继续增加时提取率开始下降，因此NaCl浓度选择在1.5 mol/L较为适宜。

2.1.2 提取温度对葵花籽粕蛋白质提取率的影响

在相同试验条件下，分别在 30、40、50、60、70 和80℃进行提取，考察不同提取温度对葵花籽粕蛋白质提取率的影响结果如图2所示。

图2 提取温度对蛋白质提取率的影响Fig.2 Effect of temperature of extraction on LBPP yield

由图2可知，蛋白质提取率随着温度的提高而增加，50℃～70℃的提取率最高，温度再提高，提取率有下降的趋势，在60℃以上，蛋白质变性明显，氮的可溶性降低。因此温度选择在60℃较为适宜。

2.1.3 料液比对葵花籽粕蛋白质提取率的影响

在相同实验条件下，分别用 1 ∶8、1 ∶10、1 ∶12、1 ∶14、1∶16 和 1∶18（g/mL）的料液比进行提取，考察不同料液比对葵花籽粕蛋白质提取率的影响结果如图3所示。

图3 料液比对蛋白质提取率的影响Fig.3 Effect of water/dry ratio of extraction on LBPP yield

由图3可知，随着料液比的增加，蛋白质的提取率也明显增加。当料液比增加到1∶12（g/mL）以后，蛋白质提取率有下降的趋势，因此料液比选择在1∶12（g/mL）比较合适。

2.2 葵花籽粕蛋白质提取工艺参数优化

2.2.1 响应面试验结果

在前面单因素试验结果的基础上，以NaCl浓度、提取温度和料液比三个因素为自变量，以葵花籽粕蛋白质提取率为响应值，设计三因素三水平的实验。实验设计和实验结果见表1、表2。

表1 Box-Behnken设计试验因素及水平Table 1 Testing factors and levels for Box-Behnken Designing

表2 响应面分析方案及试验结果Table 2 Arrangement and experimental results of responsesurface central composite design

2.2.2 模型的建立与方差分析

根据Box-Behnken中心组合设计原理，利用SAS9.1.3软件，对表2中的实验数据进行多元回归拟合，可得NaCl浓度、提取温度、料液比与葵花籽粕蛋白质提取率的二次多元回归方程为：

Y=-49.673 75+3.327 500A+1.373 750B+6.854 375C+0.013 029AB-0.135 000AC-0.032 875BC-3.360 000A2-0.009 675B2+0.016 951C2

式中A、B、C在设计中均经过量纲线性编码处理，所以上式中的各项系数的绝对值大小直接体现出各因素对响应值的影响程度大小，系数的正负反映了影响的方向。

对表2中的试验结果进行统计分析，得到的方差分析结果如表4所示。

由表3的回归方程中各变量对响应值影响的显著性，由F检验来判定，概率P值越小，则相应变量的显著程度越高。由表4方差分析可知，方程模型F值为99.4，P＜0.001，表明回归模型显著；失拟项F值为17.79，P=0.2030＞0.05，并且实验数据精密度 R2=99.44%，表明失拟项相对于绝对误差是不显著的，说明该回归方程对实验拟合情况较好。同由表3可以看出，各因素中一次项B、C是差异极显著，二次项A、B也是差异极显著，C是极显著，其次是交互项AB、BC也是极显著的，由此可见，各具体试验因素对响应值的影响不是简单的线性关系。

表3 回归模型系数显著性检验Table 3 Significance test for each term in the regression model

表4 回归模型方差分析Table 4 Variance analysis for the regression model

等高线的形状反映了交互效应的强弱，椭圆形表示两因素交互影响显著，圆形则与之相反。由图4～6可知，提取中提取温度与NaCl浓度之间的交互作用较小，NaCl浓度与料液比、料液比与提取温度之间有一定的相互作用。

2.2.3 最优葵花籽粕蛋白质提取工艺的确定

通过软件SAS9.1.3求解方程，得到葵花籽粕蛋白质的最优提取工艺条件为：NaCl浓度1.51 mol/L、料液比 1∶12.88（g/mL）、提取温度 60.27℃、对应的理论提取率响应值为36.64%。该回归方程与实际情况很吻合，说明响应面优化葵花籽粕蛋白质的提取工艺是可行的。

图4 温度和NaCl浓度对蛋白质提取率的影响Fig.4 Effects of NaCl conection and extraction time on the yield of protein

图5 NaCl浓度和料液比对蛋白质提取率的影响Fig.5 Effects of NaCl conection and wate/rdry ratio on the yield of protein

图6 温度和料液比对蛋白质提取率的影响Fig.6 Effects of extractiom time and dry/water ratio on the yield of protein

3 结论

1）与正交设计法比较，响应面分析法在试验条件寻优过程中，可以连续对试验各水平进行分析，同时，通过中心组合试验，研究几种试验因素间的交互作用，求得高精密度的回归方程，具有实验设计简单，操作方便，精确度高等优点。

2）本文在单因素试验的基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理，将响应面法应用于优化葵花籽粕蛋白质的提取工艺，通过拟合方程得到的最佳工艺条件与模型预测值基本一致。此优化的工艺参数可以有效减少操作中的盲目性，并为下一步的实验研究奠定基础。

3）我国葵花籽粕资源丰富，由于葵花籽粕中绿原酸的存在，与蛋白质分子反应生成非反刍动物无法消化的非营养成分，从而降低了蛋白质的营养价值和功能性质。本文首先从葵花籽粕中提取绿原酸，然后进一步提取优质的蛋白质，对葵花籽粕实现多次增值，具有一定的使用价值。

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