发酵促进剂对三孢布拉氏霉菌发酵的影响

李晔，何山，金丽华，兰蓉，陈思

（1.北京电子科技职业学院生物技术系，北京100029；2.北京化工大学生命科学与技术学院，北京100029）

β-胡萝卜素是500多种类胡萝卜素的一种，是橘黄色脂溶性化合物，它是一种重要的食用天然色素和营养强化剂。它不仅是VA原，具有预防眼疾、保护视力的功能，而且还具有抑制细胞变异，抗癌、防癌、抗氧自由基、增强机体的免疫力，维护人体上皮组织的正常生理功能，以及促进儿童生长发育，美容等一系列重要作用[1-5]，在世界的许多国家被广泛用作食品营养强化剂及添加剂。

至目前为止，已报导的β-胡萝卜素生产方法有天然提取法、化学合成法和发酵法三种。天然提取法以天然植物为原料，经有机溶剂提取或超临界萃取制取β-胡萝卜素，但由于原料含量太低，生产成本高居不下[6]；化学合成法可以使生产成本大幅度较低，但β-胡萝卜素复杂的结构较难用化学方法合成[7]，而且人们对化学合成品毒副作用的担心及对天然品的日益崇尚，限制了其市场的发展；利用发酵法生产β-胡萝卜素成为当前研究的前沿和热点[8]。三孢布拉氏霉菌（B.trispora）是世界上最常用的β-胡萝卜素高产菌[9-10]，在培养过程中不需要光照，生物量大。通过天然微生物发酵途径能生产β-胡萝卜素，但仍不能满足市场的需要。因此，需要进一步对B.trispora发酵生产β-胡萝卜素的条件进行优化，以进一步提高其产量，逐步缩小市场供应与人们需求之间的矛盾。通过我们的初步研究发现：改变培养B.trispora的条件，如添加不同种类的物质可以改善β-胡萝卜素的产量。因此，本文以β-胡萝卜素的发酵产量作为监测的主要指标，菌体的干重为参考指标，重点考察了在发酵培养基中添加不同种类及含量的表面活性剂，植物油，无机氮源，有机碳源等发酵生产β-胡萝卜素的影响。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株

三孢布拉氏霉菌（B.trispora），ATCC14271（+）和ATCC14272（-），本研究室提供。

1.1.2 培养基

1.1.2.1 平板培养基

土豆浸提汁1L，葡萄糖20g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.1 g，琼脂 15 g，VB1微量。

1.1.2.2 种子培养基

去离子水1L，淀粉40 g，葡萄糖25 g，玉米浆70 g，KH2PO41g，MgSO4·7H2O 0.1g，VB10.01g，去离子水1 L，pH6.5。

1.1.2.3 基本发酵培养基

淀粉40 g，大豆饼粉 40 g，玉米浆 60 g，KH2PO41 g，MgSO4·7H2O 0.1 g，VB10.01 g，去离子水 1 L，大豆精油（含有 1 g/100 mL BHT）5 mL，pH6.5。

1.2 方法

1.2.1 平板培养

接种后的平板置于29℃的恒温培养箱中培养24 h，生长4 d后取出放于室温下培养2 d，等待孢子生长。

1.2.2 种子培养

在无菌条件下，从已培养4 d的（+）/（-）平板培养基上分别挑取两环孢子接入500 mL三角瓶（装液量100 mL）的种子培养中。在28.5℃、180 r/min的条件下培养40 h。

1.2.3 摇瓶发酵培养

在无菌条件下，将正负菌以1∶4比例混合均匀，按照接种量20%接入500 mL三角瓶（装液量100 mL）的发酵培养基中。在28.5℃、220 r/min的条件下，培养120 h，代谢产物为β-胡萝卜素。

1.2.4 细胞干重测定

将发酵结束后的湿菌体用纱布过滤，在45℃条件下真空干燥，恒重后称量得到菌体干重（DCW），即生物量。

1.2.5 β-胡萝卜素含量的测定

由于番茄红素的测定较为复杂，而β-胡萝卜素作为其前体物其含量可以指示出番茄红素的含量。因此通过测定β-胡萝卜素的含量来进行说明。由于β-胡萝卜素为胞内产物，需要将菌体碾磨以便提取β-胡萝卜素。实验取0.08 g发酵所得干菌体，添加适量抗氧化剂BHT研磨后用石油醚萃取，过滤后定容于25 mL棕色容量瓶中。

1.2.6 高效液相色谱法

HPLC 分离柱为 Diamonsil C18，5 μm，250 mm ×416 mm；流动相为乙腈与二氯甲烷，体积比为75∶25；检测波长450 nm；柱温28℃；流速1.5 mL/min。

2 结果

2.1 大豆精油对发酵的影响

根据国内外的一些研究报道，在B.trispora发酵生产β-胡萝卜素过程中，添加植物油有利于β-胡萝卜素的合成。植物油中含有大量的不饱和脂肪酸，在发酵培养基中添加脂肪酸有利于β-胡萝卜素的合成，其中不饱和脂肪酸比饱和脂肪酸影响大。在B.trispora发酵培养基中添加植物油，不仅可以提供菌体需要的能量与碳源，而且还为β-胡萝卜素的合成提供双键。因为不同植物油中含有的不饱和脂肪酸的成分和比例不同，本研究中我们选用大豆精油和棉籽粗油进行实验。在发酵基本培养基的基础上分别添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%（体积分数）的大豆精油进行实验。添加后分析发酵的生物量和β-胡萝卜素产量，结果如图1所示。

图1 大豆精油对B.trispora发酵的影响Fig.1 The effect of soybean oil on the B.trispora fermentation

2.2 棉子粗油对发酵的影响

在发酵基本培养基的基础上分别添加0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%%、4.0%、5.0%（体积分数）的棉籽粗油进行实验。添加棉籽粗油后分析发酵的生物量和β-胡萝卜素产量结果如图2所示。

2.3 表面活性剂Span80对发酵的影响

图2 棉籽粗油对B.trispora发酵的影响Fig.2 The effect of cottonseed oil on the B.trispora fermentation

进行表面活性剂条件优化时，在发酵基本培养基的基础上添加 0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%（体积分数）的表面活性剂Span80进行实验。分析发酵的生物量和β-胡萝卜素产量，结果如图3所示。

图3 表面活性剂Span80对B.trispora发酵的影响Fig.3 The effect of surfactant Span80 on the B.trispora fermentation

2.4 表面活性剂Tween20对发酵的影响

进行表面活性剂条件优化时，在发酵基本培养基的基础上添加 0%、0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3.0%（体积分数）的表面活性剂Tween20进行实验。分析发酵的生物量和β-胡萝卜素产量，结果如图4所示。

图4 表面活性剂Tween20对B.trispora发酵的影响Fig.4 The effect of surfactant Tween20 on the B.trispora fermentation

2.5 无机氮源硝酸钠对发酵的影响

不同的有机氮源和无机氮源对生物量和β-胡萝卜素产量的影响不一样。在发酵基本培养基的基础上分别添加 0%、0.25%、0.5%、0.75%、1.0%（w/v）的无机氮源硝酸钠进行实验。分析发酵的生物量和β-胡萝卜素产量，结果如图5所示。

图5 无机氮源硝酸钠对B.trispora发酵β-胡萝卜素含量的影响Fig.5 The effect of Inorganic nitrogen source sodium nitrate on βcarotene by mated culture of B.trispora

2.6 有机碳源丙二酸钠对发酵的影响

培养基一般使用的有机碳源有：单糖、双糖、多糖、油脂和脂肪酸等。对于调节微生物生长代谢情况也是极其重要的，影响到目标产物的合成。在发酵基本培养基的基础上分别添加0%、0.5%、1.0%、2.0%、3.0%（w/v）的有机碳源丙二酸钠进行实验。分析发酵的生物量和β-胡萝卜素产量，结果如图6所示。

图6 有机碳源丙二酸钠对B.trispora发酵的影响Fig.6 The effect of organic carbon source sodium malonate on βcarotene by mated culture of B.trispora

3 讨论

3.1 植物油对B.trispora发酵的影响

大豆精油的添加对B.trispora发酵的生物量提高有非常重要的作用，图像整体呈现升高趋势。随着大豆精油的添加量增多，菌体的生物量明显升高，在添加量为5.0%（体积分数）时有最大值5.06 g，不添加大豆精油时的生物量仅为0.77 g，菌体几乎不生长，添加量为5.0%（体积分数）时的提高率为557.14%，效果极其明显，为发酵过程中的必需添加物。棉籽粗油的添加对B.trispora发酵的生物量提高有很大帮助，图像整体呈现升高趋势，涨幅明显。随着棉籽粗油的添加量增多，菌体的生物量明显升高，在添加量为5.0%（体积分数）时有最大值6.34 g，不添加棉籽粗油时菌体几乎不生长，添加棉籽粗油对提高菌体生物量的作用极其明显，是发酵过程中的重要添加物。比较大豆精油和棉籽粗油对B.trispora的生物合成量的影响发现，二者均在添加量为5.0%（体积分数）时有最大值，但是后者比前者提高了25.30%，可见在生物量方面，5.0%（体积分数）棉籽粗油效果最好。

大豆精油的添加对B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量提高有非常重要的作用，图像整体呈现升高趋势，涨幅明显，在添加量1.5%（体积分数）后有小幅回落。大豆精油的添加使得菌体产生的β-胡萝卜素含量明显升高，在添加量为1.5%（体积分数）时有最大值133.5mg/L，不添加大豆精油时的生物量仅为6.573mg/L，菌体几乎不合成产物，添加量为1.5%（体积分数）时的提高率为1 931.04%，效果极其明显，为发酵过程中的必需添加物。棉籽的添加对B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量提高也有非常大的作用，图像整体呈现先升高，再下降趋势，在添加量1.5%（体积分数）后明显下降。在添加量为1.5%（体积分数）时有最大值80.232 mg/L，不添加大豆精油时菌体几乎不合成产物，添加量为1.5%（体积分数）时效果极其明显，为发酵过程中的重要添加物。比较大豆精油和棉籽粗油对B.trispora的β-胡萝卜素含量的影响发现，二者均在添加量为1.5%（体积分数）时有最大值，但是大豆精油的效果优于棉籽粗油，可见在β-胡萝卜素含量方面，添加1.5%（体积分数）大豆精油效果最好。

3.2 表面活性剂对B.trispora发酵的影响

表面活性剂是一类分子中含有亲水基和亲油基，即双亲结构的有机化合物。研究证明，表面活性剂影响微生物产酶活性的机理应该是在促进菌体生长的同时，改变了细胞表面性质和堆料环境中的界面张力及胶团性质，促进了酶的释放和介质的分散吸收。丝状真菌在液体培养基中的菌体形态对发酵生产有非常重要的影响。一方面，菌体形态影响培养液的流体特性和传质特性；另一方面，菌体形态是微生物生理学和代谢的表达。根据其特性，微生物在发酵液中的菌体形态，可以分为：菌丝球聚集体、粗糙菌丝球、平滑菌丝球、菌丝块、分散菌丝体[11]。另有研究表明[12]，菌丝形态会受到菌株内外两方面的因素的影响。比如，基因、细胞壁结构、营养成分、搅拌、培养液粘度、表面活性剂的添加等，都会对发酵的菌体形态造成影响，进而影响菌体的生长和代谢，影响代谢产物的生成。文献中报道，有些添加物，如表面活性剂、煤油等的添加，会改变发酵的菌丝形态，从而影响菌体的生长和产物的合成。在B.trispora发酵培养基中加入合适的表面活性剂，β-胡萝卜素产量有很大程度的提高[13]。非离子型表面活性剂能防止菌丝体在生长过程中的聚集，因而液体培养基中的营养成分能快速进入菌丝细胞，为细胞生长代谢所利用。我们选用了两种非离子型表面活性剂Span80和Tween20分别考察对B.trispora发酵的影响。通过图3和4的数据可以看出Span80对B.trispora发酵的生物量提高没有帮助，整体在小范围内波动，但是各个浓度下的生物量均低于不添加时的含量。Tween20对B.trispora发酵的生物量提高也没有帮助，各个浓度下的生物量均明显低于不添加时的含量。而对于β-胡萝卜素产量的影响则不同，Span80的添加使得B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量出现先上升再下降趋势，虽然在添加量为0.5%（体积分数）时出现最大值117.003 mg/L，但是相对空白值108.167 mg/L仅提高了8.17%，效果并不明显。Tween20的添加使得B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量出现先上升再下降趋势，在添加量为0.5%（体积分数）时出现最大值133.105mg/L，相对空白值108.167mg/L提高了23.06%，效果比较明显。因此在这两种表面活性剂中，添加0.5%（体积分数）的Tween20是提高菌体β-胡萝卜素含量的最优条件。分析原因，可能是因为两者的HLB值不同（Span80的HLB值为4.3，Tween20的HLB值为16.7）HLB值越大，表示该表面活性剂的亲水性越强，Tween20的水溶性比Span20要好，故在发酵培养基中的溶解性Tween20更有优势，便于利用。

3.3 无机氮源对B.trispora发酵的影响

氮是构成微生物细胞中核酸和蛋白质的重要元素，可以影响代谢过程所需酶的合成，同时氮源对于微生物的生长和代谢也是非常重要的，无机氮源和有机氮源都是影响微生物目标产物形成和微生物菌体本身生长的关键因素，对于B.trispora也不例外。如图6所示无机氮源硝酸钠对B.trispora发酵的生物合成量起到抑制，图像呈现明显的下降趋势，随着硝酸钠的添加量增大，生物合成量不断降低，降幅明显，可见无机氮源硝酸钠对B.trispora发酵的生物合成起到阻碍作用。无机氮源硝酸钠对提高B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量没有作用，图像呈现明显的下降趋势，随着硝酸钠的添加量增大，β-胡萝卜素含量不断降低，降幅明显，可见无机氮源硝酸钠对B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量起到阻碍作用。

综合评价无机氮源硝酸钠对于B.trispora的生物合成量和β-胡萝卜素含量均起到抑制作用，因此不适合作为培养基添加物。

3.4 有机碳源对B.trispora发酵的影响

碳源是构成微生物细胞结构和代谢产物中碳架来源的重要营养物质。微生物利用碳源物质具有选择性，不同的微生物或原生长环境不同的同种微生物，对碳源的利用是有区别的。如图5所示有机碳源丙二酸钠的添加对B.trispora发酵的生物量提高有一定的作用，图像整体呈现升高，下降趋势，涨幅较为明显，在添加量2.0%（w/v）后有小幅回落。有机碳源丙二酸钠使得菌体的生物量有所升高，在添加量为2.0%（w/v）时有最大值5.63 g，不添加丙二酸钠时的生物量为5.11 g，提高了 10.18%。

有机碳源丙二酸钠的添加对B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量提高有重要的作用，图像整体呈现先升高后下降趋势，在添加量为1.0%（w/v）时有最大值112.326 mg/L，不添加时的β-胡萝卜素含量仅为71.566 mg/L，提高率为56.95%，效果非常明显。因此添加1.0%（w/v）的丙二酸钠对B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量提高有很大的帮助，是提高其产量的一种有效手段。

综合评价有机碳源丙二酸钠对于B.trispora的生物合成量和β-胡萝卜素含量均起到提高作用，添加量为2.0%（w/v）时生物量提高了10.18%。添加量为1.0%（w/v）时β-胡萝卜素含量提高率为56.95%，效果非常明显。因此在培养基中添加1.0%（w/v）的丙二酸钠对B.trispora发酵的β-胡萝卜素含量提高有很大的帮助，可以优化发酵结果。

4 结论

发酵培养基是用于生产预定发酵产物的培养基，是供菌体生长、繁殖和合成产物之用。它既要使种子接入培养基后能迅速生长，达到一定的菌体浓度，更重要的是使长好的菌体能迅速合成所需产物[14]。我们对培养基成分进行初步确定，以达到最大量的发酵最终产物β-胡萝卜素。以β-胡萝卜素的发酵产量作为监测的主要指标，菌体的干重为参考指标选择发酵培养基。为进一步培养条件的优化提供基础。

取原始正菌（+）和原始负菌（-）按照1∶4混合培养，在基础培养基上分别添加0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、3%（体积分数）的span80和Tween20；0.5%、1.0%、1.5%、2.0%、2.5%、3.0%、4.0%、5.0%（体积分数）的大豆精油和棉籽粗油；0.25%0.5%0.75%1%（w/v）的无机氮源硝酸钠；0.5%、1.0%、2.0%、3.0%（w/v）的有机碳源丙二酸钠进行发酵培养，检测产物的生物量和β-胡萝卜素含量，通过分析数据得出较优的添加物及其浓度。经过大量的发酵实验得出以下结论：

1）比较Span80和Tween20两种表面活性剂对B.trispora的β-胡萝卜素含量的影响发现，在添加量为0.5%（体积分数）时出现最大值133.105 mg/L，相对空白值108.167 mg/L提高了23.06%，效果比较明显，添加0.5%（体积分数）的Tween20是提高菌体β-胡萝卜素含量的最优条件。

2）比较大豆精油和棉籽粗油对B.trispora的β-胡萝卜素含量的影响发现，二者均在添加量为1.5%（体积分数）时有最大值，且添加1.5%（体积分数）大豆精油效果最好。

3）比较不同添加量的无机氮源硝酸钠对于B.trispora的生物合成量和β-胡萝卜素含量均起到抑制作用，因此不适合作为培养基添加物。

4）比较不同添加量的有机碳源丙二酸钠对于B.trispora的生物合成量和β-胡萝卜素含量，发现丙二酸钠的添加量为1.0%（w/v）时β-胡萝卜素含量有最大值112.326 mg/L，不添加时仅为71.566 mg/L，提高了56.95%。因此添加1.0%（w/v）的丙二酸钠对β-胡萝卜素含量提高有很大的帮助，可以优化发酵结果。

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