直接稀释-液相色谱法快速测定葡萄酒中的甘油和糖

葛宝坤，杨爽，俞子萱，赵滨岩

（天津出入境检验检疫局，天津300461）

近年来，随着人们生活水平的提高，葡萄酒已逐渐成为普通百姓餐桌上的重要饮品，但葡萄酒被检出标签不合格、重金属、添加剂超限量使用、生产劣质假冒葡萄酒的情况时有发生[1]，因此葡萄酒的真伪与质量的好坏是关系到人们身体健康的重要因素。葡萄酒的酿造是糖类化合物发酵生产乙醇的过程，甘油则是发酵过程中生成的主要副产物之一，存在于各类葡萄酒中，是干型、半干型葡萄酒的主要组成成分，酒精发酵过程中多产甘油可使酒味醇和圆润，是决定葡萄酒质量的主要成分[2]，检测甘油含量可以为鉴定原酒含量、识别掺假酒提供依据；葡萄酒中的总糖量是影响葡萄酒质量和区分葡萄酒种类的重要指标之一[3]，检测葡萄酒中含糖量一是了解葡萄汁发酵的程度，二是测定葡萄酒中含糖量，三是计算出葡萄酒中的干浸出物，根据GB2760-2011《食品添加剂卫生标准》，葡萄酒中不得添加任何形式的糖醇，对葡萄酒进行本地调查，建立相关产地葡萄酒中甘油、糖的种类、含量信息库显得尤为重要。

目前检测葡萄酒中甘油和含糖量的方法较多，如气相色谱法[4]、液相色谱法[5-6]、衍生-GC-MS 法[1]、SPE净化-液相色谱法[7]、液相色谱-蒸发光散射法[8]、液相色谱-串联质谱法[9-10]、化学法[11-12]等，但上述方法或存在检测灵敏度低、或存在操作繁琐复杂、或存在检测成本高、设备购置昂贵等不足；本法采用30%的乙腈水直接稀释-液相色谱分离-视差折光检测器检测同时测定葡萄酒中甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖化合物含量的方法未见报道，实验研究结果表明，该方法克服了上述文献方法中的不足，且具有简便、快速、灵敏、稳定、污染小、检测成本低等特点，便于批量检测的推广与应用。

1 仪器、试剂及方法

1.1 仪器

e2695高效液相色谱仪（配2414视差遮光检测器）：Waters公司；MILLI-Q纯水仪：MILLIPORE公司；固相萃取柱（型号：SAX；规格：150 mg/3 mL）：北京迪马科技公司。

1.2 试剂

乙腈：色谱纯；甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖（分析纯含量≥99%）：天津化学试剂三厂生产；甘油、糖混合标准储备液的配制：分别准确称取一定量的上述标准品，用去离子水溶解、混匀、定容，即为标准储备液，其中果糖、葡萄糖、蔗糖浓度为20.0 mg/mL，甘油浓度为10 mg/mL；标准使用液是将储备液用去离子水稀释至所需要的浓度。

1.3 方法

1.3.1 样液的制备

取2 mL葡萄酒样于15 mL离心管中，用30%的乙腈水直接稀释定容至10 mL，混匀，过0.45 μm滤膜作为甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖分离样液进高效液相色谱仪分析测定。

1.3.2 高效液相色谱条件

色 谱 柱 ：WATERS，ENERGY ANALYSIS NH2，300 mm×3.9 mm，10 μm，或相当者；流动相：乙腈+水=80%+20%；流速：1.0 mL/min；柱温：30℃；检测池温度：35 ℃；进样量：10 μL。

1.3.3 分析测定

根据样液中被测甘油、糖的含量情况，选定峰面积相近的标准工作液，标准工作液和待测样液中甘油、糖的响值均应在工作曲性范围内，对标准工作液和待测样液等体积参插进样测定。

2 结果与讨论

2.1 方法的回收率与精密度

在1.3.2的色谱条件下，标准品色谱图和保留时间见图1。

图1 色谱条件下标准品色谱图Fig.1 Standard chromatograph

取葡萄酒样品2 mL，按照0.25、2.5、25.0 g/L 3个加标水平，按本方法进行加标回收试验，并做6个平行样，结果为甘油、果糖、葡萄糖、蔗糖的平均回收率均在96%～102%，精密度小于8.0%，本方法的稳定性良好，结果见表1。

2.2 方法的标准曲线及线性关系

取一定浓度混合标准溶液，用30%的乙腈水分别稀释成浓度分别为 0.05、0.10、0.20、0.50、1.00、2.0、5.0mg/mL，按照本方法色谱条件分析测定，绘制工作曲线，4种成分在0.05 mg/mL～5.0 mg/mL浓度范围内有良好线性关系，其相关系数均大于0.999 5，结果见表1。

表1 方法的加标回收率、变异系数、检测限（n=10）Table 1 The Recovery，correlation-coefficient，LOD，LOQ（n=10）

2.3 方法的测定限

取葡萄酒样品约2 mL，加入混合标准溶液2 mL，逐级稀释后按照本方法色谱条件测定样品加标结果，根据信噪比S/N=10为本方法的定量限（LOQ）、S/N=3为本方法的定性限（LOD）计算出方法的最低检测限，结果见表1。

2.4 方法的适用性

为了确定方法的抗干扰能力及适用性，分别选取常见的干红、干白、甜白、起泡酒、半干高泡葡萄酒样品，按照本方法条件进行测试，结果显示四种待测组分的色谱峰分离度和重现性均较好，样品中的色素有机酸、挥发性酚、醛类等成分均不干扰结果测定。

2.5 稀释液配比的优化

研究了水、甲醇水、乙腈水直接稀释法对测定结果的影响，研究表明：甲醇水因含有醇羟基对视差折光检测器有较大的吸收而影响测试结果；直接用水稀释不仅会形成较大的水峰，而且水峰还不能与甘油峰完全分开，造成测试结果的偏离；另对乙腈水的配比研究还发现：采用30%的乙腈水直接稀释样品可使水峰较小、水峰与甘油的保留时间相差1.0 min、4种待测成分分离较高、基线噪音低，因此，本研究优选30%的乙腈水（体积比）为样品直接稀释液。

2.6 本方法与GB/T15038-2006中的SPE方法比较

为确定本方法具有简便、快速、灵敏、成本低的特点，应用本方法与国标方法GB/T15038-2006的SPE法，对天津口岸来自美国、法国、意大利、智力、西班牙、罗马尼亚共16批次的葡萄酒样品的测试结果比较发现，在待测组分含量≤1.0g/L时，SPE方法测定结果的稳定相较差，变异系数大于10%，待测组分含量≥1.0 g/L时，二者测试结果的差别无显著性。因此，直接稀释法较SPE法更具有操作简单、快速，不需要SPE净化柱、试剂消耗少、对环境污染小等特点。

3 结果

本文研究的检测方法4种待测组分在0.05mg/mL～5.0 mg/mL浓度范围内，有良好的线性关系，相关系数大于0.999 5；样品在0.25、2.5、25.0 g/L 3个加标水平内的回收率范围为96%～102%，6次测定的相对标准偏差小于8.0%；方法的定性检出限（LOD）为0.04 g/L、定量检出限（LOD）为0.10 g/L，符合色谱分析的方法要求。本研究方法较国标SPE法更具有操作简单、快速、灵敏、不需要SPE净化柱、试剂消耗少、对环境污染小等特点，便于推广与应用。

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