摄食羟丙基壳聚糖对小鼠体内铅水平的影响

王志华，颜永斌，江阳阳，李伟，覃彩芹，*

（1.特色果蔬质量安全控制湖北重点实验室，湖北工程学院，湖北孝感432000；2.生物质资源化学与环境生物技术湖北省重点实验室，湖北工程学院，湖北孝感432000）

壳聚糖是自然界中仅次于纤维素的第二大可再生资源，广泛存在于虾、蟹等甲壳类动物外壳及真菌细胞壁。作为自然界中唯一的含氮碱性多糖，壳聚糖具有良好的生物降解性、生物相容性，安全无毒，广泛应用于医药、纺织、化妆品、造纸、食品工程、化工、农业等领域[1-2]。大量研究表明，壳聚糖具有抗肿瘤、降胆固醇、增强免疫功能、抗糖尿病、愈伤和抗菌等多种生物学活性[3-6]。自1983年美国食品药物管理署（Food and Drug Administration，FDA）批准壳聚糖作为饲料添加剂以来，壳聚糖及其衍生物在食品工业中的应用日益受到社会的关注，如抗菌剂、抗氧化剂、水果保鲜剂等[7-8]。

壳聚糖分子中每个糖残基上存在相邻的氨基和羟基，在一定的pH条件下，能够有效络合金属离子[9]。我们已有的研究显示摄食不同分子量的壳聚糖及其衍生物对小鼠体内金属元素的影响不同。用含1%样品的基础饲料喂食小鼠90 d，不同分子量的壳聚糖[10]及其羟丙基壳聚糖（hydroxypropyl chitosan，HPCS）衍生物[11]对小鼠体内肝、心、肾等组织中Fe和Zn含量没有明显影响，但是用含0.75%样品的基础饲料喂食小鼠30 d，羧甲基壳聚糖[12]和季铵化壳聚糖[13]却明显降低了小鼠体内肝、心、肾等组织中Fe和Zn含量。壳聚糖的衍生化产物有不同的理化性质，也会影响其在体内的生化作用。

铅作为联合国粮农组织（Food and Agriculture Organization of the United Nations，FAO）公布的对人体毒性最强的三种重金属（铅、镉、汞）之一，广泛分布并共存于自然界中，是环境中常见的化学毒物。随我国社会经济的快速发展，自然环境的铅污染日益严重，已引起人们的高度重视。长期饮食受不同程度铅污染的食品和饮用水，对人体健康产生多方面的危害，甚至引起铅中毒。对于铅中毒，临床上普遍采用二巯丁二酸、依地酸二钠钙等药物治疗，排铅效果虽好，导致诸多不良反应，并且这种治疗方法不宜用于铅慢性中毒的预防及治疗[14]。我们前期研究显示分子量较大的水溶性壳聚糖使小鼠的毛发、肝、脾和心脏中的Pb含量有所降低[15]。水溶性HPCS没有明显的急性毒性[16]，但是摄食它对元素Pb是否有富集或促排作用不甚清楚。本文探讨摄食HPCS对正常小鼠体内铅水平的影响。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

壳聚糖：浙江金壳生物化学有限公司，65%浓HNO3和HClO4为优级纯试剂，其他试剂均为分析纯。昆明小鼠（18 g～22 g）和其食用的基础饲料（19.1%粗蛋白，12.13%氨基酸，4.80%粗纤维，4.25%粗脂肪，7.17 mg/kgCu，525.97mg/kgFe，85.19mg/kgZe，1.198mg/kg Pb，5.47 g/kg Ca）由湖北省实验动物中心提供。

1.2 仪器与设备

倒置荧光显微镜，日丰尼康公司；TAS-986原子吸收分光光度计，北京普析通用仪器有限责任公司。

1.3 方法

1.3.1 HPCS的制备

将一定量壳聚糖分散在异丙醇中，加入一定量33%NaOH水溶液，-18℃冷冻碱化48 h；室温解冻后，加入一定量的环氧丙烷和10%的四甲基氢氧化铵溶液，将混合物在45℃下搅拌回流过夜；所得的产物用1∶1（体积比）HCl中和至中性，用蒸馏水透析3 d，除去其中的盐份，所得溶液在60℃下减压浓缩，用大量的丙酮沉淀后，将沉淀物真空干燥即得HPCS衍生物。其分子量测定采用凝胶渗透色谱法，按照我们已发表的论文方法操作[17]。HPCS的重均分子量Mw为 1.6×105。

1.3.2 摄食HPCS对小鼠体内铅水平影响的实验

将40只健康的雌性昆明小鼠随机分为四个组，一个对照组喂食小鼠基础饲料，三个实验组分别喂食质量分数为1.5%、1.0%、0.1%HPCS的饲料。持续喂养，每周称重，第90天将小鼠颈椎脱臼处死，取出肝脏、肾脏、脾脏、心脏和股骨称重。抽取1.5%HPCS实验组和对照组小鼠部分肝脏，经固定、脱水、浸蜡、包埋、切片，每隔20张取一张，每个材料取4张，脱蜡，苏木精-伊红（hematoxylin-eosinstaining，HE）染色制片，分别在放大倍数为10×40的倒置荧光显微镜下观察拍照。

称取0.1 g～0.2 g脏器和股骨，向其中加5 mL HNO3和1 mL HClO4在150℃条件下消解为澄清液，冷却后用双蒸馏水定容至10.00 mL。用TAS-986原子吸收分光光度计通过石墨炉法测定样品中的Pb2+浓度。最后采用SPSS11.5生物统计学One-Way ANOVA进行数据处理，比较实验组与对照组的差异。

2 结果与分析

2.1 摄食HPCS对小鼠体重的影响

小鼠摄食含有0.1%，1.0%和1.5%HPCS的基础饲料90 d，在实验期内活动、生长正常，均未表现临床的中毒症状。其体重的变化见表1。

表1 小鼠体重的变化（g，±s，n=10）Table 1 Body weight changes of mice（g，±s，n=10）

表1 小鼠体重的变化（g，±s，n=10）Table 1 Body weight changes of mice（g，±s，n=10）

?

如表1所示，各组小鼠初始体重相近，实验结束时，HPCS实验组与对照组无明显差异。小鼠的脏器指数变化结果见表2。

表2 小鼠体重的脏器指数（g/100 g，±s，n=10）Table 2 Organ/body weight ratios of the mice（g/100 g，±s，n=10）

表2 小鼠体重的脏器指数（g/100 g，±s，n=10）Table 2 Organ/body weight ratios of the mice（g/100 g，±s，n=10）

?

可以看出摄食HPCS对肝、肺、心、脾、肾等的脏器指数无明显影响。图1显示在显微镜下观察肝组织，实验组与对照组相比无异常，肝细胞成行排列成整齐的肝索，肝窦清晰可见，核仁清晰，胞浆丰满，表明HPCS对肝组织无损伤。

图1 小鼠肝脏组织HE染色照片Fig.1 The micrographs of mouse liver tissue stained by HE

2.2 摄食HPCS对小鼠器官中铅含量的影响

摄食HPCS 90 d对小鼠器官中铅含量影响见表3。

表3 摄食HPCS 90 d小鼠器官中铅含量（μg/kg，±s，n=10）Table 3 The concentrations of Pb in organs of the mice（μg/kg，±s，n=10）

表3 摄食HPCS 90 d小鼠器官中铅含量（μg/kg，±s，n=10）Table 3 The concentrations of Pb in organs of the mice（μg/kg，±s，n=10）

注：bP＜0.01。

?

可以从表3中看出，各实验组小鼠的肝、脾、心和肾中的铅含量与对照组相比无统计学意义，但1.0%HPCS和1.5%HPCS样品组股骨中的铅含量与对照组相比呈极显著性差异（p＜0.01）。

3 讨论

铅是一种蓄积性毒物，居6类重金属污染之首，被世界卫生组织列为可能的致癌物质之一。环境中的铅主要通过消化道吸入体内，大量研究表明铅对全身各系统和器官均有毒性作用，尤其对儿童、孕妇的危害性更大，对发育中的神经系统损伤尤为明显[19]。铅经主动转运和被动扩散两种方式由小肠吸收入血[20]，进入血液的铅，形成可溶性的铅盐，并随血液分布在肝、肾、脑等组织器官，数周后95%的铅转移到骨性组织，沉积在骨骼系统。骨组织是体内最大的铅储存库，因此，骨铅含量可以比较确切地反应排铅和驱铅的效果。小鼠摄食HPCS后，1.5%HPCS组和1.0%HPCS组与对照组相比，股骨中铅水平显著下降。HPCS分子含有氨基，在适当条件下能够络合金属阳离子。饲料中添加的HPCS有可能在血液中络合铅离子进入肝组织，致使肝中Pb含量增加，但是随着HPCS量增加，有效吸附基团的增多，使得被吸收的HPCS分子对Pb吸附量增加，然后通过肾代谢除去Pb，使骨中Pb含量下降。

摄食HPCS对小鼠体重无明显影响，对肝组织器官无损伤，没有造成重金属铅在体内的蓄积，虽然小鼠摄食1.0%和1.5%HPCS的基础饲料使股骨铅水平明显下降，其作用机理及其排铅效果有待进一步研究。

[1] Kumar M N V R,Muzzarelli R A A,Muzzarelli C,et al.Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives[J].Chemical Reviews,2004,104:6017-6084

[2]Bansal V,Sharma P K,Sharma N,et al.Applications of chitosan and chitosan derivatives in drug delivery[J].Advances in Biological Research,2011,5:28-37

[3]Qin C Q,Li H R,Xiao Q,et al.Water-solubility of chitosan and its antimicrobialactivity[J].CarbohydratePolymers,2006,63:367-374

[4] Gades D M,Stern J S.Chitosan supplementation and fecal fat excretion in men[J].Obesity Research,2003,11:683-688

[5] Qin C Q,Du Y M,Xiao L,et al.Enzymic preparation of water-soluble chitosan and their antitumor activity[J].International Journal of Biological Macromolecules,2002,31:111-117

[6] Gallaher C M,Munion J,Hesslink J R,et al.Cholesterol reduction by glucomannan and chitosan is mediated by changes in cholesterol absorption and bile acid and fat excretion in rats[J].Journal of Nutrition,2000,130:2753-2759

[7] 匡银近,龙晶,徐东生,等.不同分子量的壳聚糖在草莓保鲜中的作用[J].食品科学,2010,31(2):241-244

[8] Harish Prashanth K V,Tharanathan R N.Chitin/chitosan:modifications and their unlimited application potential[J].Trends in Food Science&Technology,2007,18:117-131

[9] Varma A J,Deshpande S V,Kennedy J F,et al.Metal complexation by chitosan and its derivatives:a review[J].Carbohydrate Polymers,2004,55:77-93

[10]Zeng L T,Qin C Q,Wang W,et al.Effect of dietary chitosans on trace iron,copper and zinc in mice[J].Carbohydrate Polymers,2008,74(2):279-282

[11]Wang Z H,Yan Y B,Jiang Y Y,et al.Effect of orally administered hydroxypropyl chitosan on the levels ofiron,copper,zinc and calcium in mice[J].International Journal of Biological Macromolecules,2014,64:25-29

[12]Wang W,Qin C Q,Ding Y,et al.Effect of dietary carboxymethyl chitosans on the levels of iron,zinc and copper in mice[J].Carbohydrate Polymers,2010,81(2):203-206

[13]Wang L S,Qin C Q,Wang W,et al.Effect of orally administered N-(2-hydroxyl)propyl-3-trimethyl ammonium chitosan on the levels of iron,zinc,copper,calcium and lead in mice[J].Carbohydrate Polymers,2011,84(2):1289-1292

[14]杨树,陈立,尹艳艳,等.喷替酸锌钠对铅中毒小鼠的驱铅作用研究[J].解放军药学学报,2011,27(2):147-149

[15]覃彩芹,曾林涛,李伟.摄食壳聚糖对小鼠体内铅水平的影响[J].食品科学,2009,30(1):246-248

[16]Peng Y F,Han B Q,Liu W S,et al.Preparation and antimicrobial activity of hydroxypropyl chitosan[J].Carbohydrate Research,2005,340:1846-1851

[17]Qin C Q,Zhou B,Zeng L T,et al.The physicochemical properties and antitumor activity of cellulase-treated chitosan[J].Food Chemistry,2004,84:107-115

[18]王龙昌,王恬,周岩民.动物食品中铅污染现状及饲料控制技术研究进展[J].食品科学,2010,31(13):302-306

[19]Flora G,Gupta D,Tiwari A.Preventive efficacy of bulk and nanocurcumin against Lead-induced oxidative stress in mice[J].Biological Trace Element Research,2013,152:31-40

[20]Fairweathr-Tait S,Hurrell R F F.Bioavailability of mineral and trace elements[J].Nutrition Research Reviews,1996,9:295-324