解毒消癥饮对肝癌侧群细胞增殖和相关因子表达的影响

陈旭征 黎金浓 胡海霞 魏丽慧 廖联明 杜建

解毒消癥饮对肝癌侧群细胞增殖和相关因子表达的影响

陈旭征 黎金浓 胡海霞 魏丽慧 廖联明 杜建

目的从肝癌干细胞角度探讨解毒消癥饮抑制肝癌的机制。方法解毒消癥饮乙酸乙酯提取物（EE-JXY)体外干预Hep3B细胞后采用MTT检测细胞存活率；平板克隆实验检测细胞的克隆形成能力；流式细胞仪分析细胞中侧群（SP）细胞的含量；RT-PCR检测干细胞相关基因CD133、Oct4、Nanog和Sox2 mRNA的表达。不同浓度组细胞存活率值比较采用单因素方差分析。结果与空白组相比，EE-JXY剂量和时间依赖性抑制Hep3B细胞的存活，0.25 mg/ml浓度干预24 h后，抑制率达34.37﹪（P< 0.01）。克隆形成能力也受到明显抑制（吸光度从0.45±0.06下降至0.29±0.03，P< 0.05）。EE-JXY组SP细胞的含量显著降低（从2.27﹪下降至0.8﹪），CD133、Oct4、Nanog和Sox2 mRNA的表达均受到抑制。结论EE-JXY能显著抑制Hep3B细胞的增殖，可能的机制与其下调干细胞相关因子CD133、Oct4、Nanog、Sox2 mRNA的表达及SP的比例，干扰肝癌干细胞自我更新有关。

解毒消癥饮；肝肿瘤；干细胞

古代医家认为恶性肿瘤的发生多是由阴精亏损、热毒蕴结，阻塞于经络脏腑所致。故清泄里热，消除热毒是治疗恶性肿瘤热毒证候的关键。解毒消癥饮主要由具有寒凉解毒之功效的白花蛇舌草、夏枯草、山慈菇和苦参组成，应用于术前，或无法手术或放化疗的晚期肿瘤患者。临床研究证实术前联合解毒消癥饮治疗肝癌患者，能显著提高其6、12、24及36个月的累计生存率，降低2年的复发率，有效控制肝癌的复发和转移[1]。因此，进一步从分子水平深入研究该方抗肝癌复发转移的机理，对提高肝癌的治疗水平有重要意义。

前期研究发现解毒消癥饮能显著下调肝癌皮下移植瘤体干细胞相关因子CD133和c-kit的表达水平，可能具有干扰肝癌干细胞自我更新的作用[2]。本文建立人肝癌细胞株Hep3B的培养体系，从克隆形成、侧群（side population，SP）细胞含量和干细胞相关因子CD133、Oct4、Nanog、Sox2 mRNA的表达水平的角度着手，深入研究解毒消癥饮调控肝癌干细胞自我更新的机制，为解毒消癥饮防治肝癌复发转移的理论提供可靠的依据。

材料与方法

一、试剂

本研究中使用的试剂包括：高糖DMEM培养基（Hyclone公司），胎牛血清（GIBCO公司），胰蛋白酶（Hyclone公司），MTT（Invitrogen公司），Trizol（Invitrogen公司），反转录试剂盒（Promega公 司），Hoechst33342染 料（Sigma公司），Verapamil（Sigma公司），碘化丙啶（PI，南京凯基公司），结晶紫染料（碧云天公司）。ABCG2引物（上海生工公司）。

二、细胞培养

人肝癌细胞株Hep3B购自中国科学院上海生命科学研究院，采用含10﹪胎牛血清、1×105U/L的青链霉素的高糖DMEM培养基培养，置于37℃、5﹪CO2饱和湿度的培养箱（HERAcell）中培养及传代。

三、药物制备

白花蛇舌草150 g、夏枯草75 g、山慈菇75 g、苦参75 g购自香港培力药业有限公司。制备步骤详见文章[3]中描述。

四、实验方法

1.MTT法观察EE-JXY对Hep3B肝癌细胞存活率的影响：调整细胞浓度为1×104个/ml接种在96孔板，分别加入含0，0.0625，0.125，0.25，0.5 mg/ml的EE-JXY的高糖DMEM培养基100 μl，干预24 h后弃去上清液，每孔加入0.5 mg/ml的MTT 100 μl，继续培养4 h，弃上清，加入100 μl DMSO终止反应。用490 nm波长的酶标仪（BioTek）检测吸光度（A），空白组调零。存活率（﹪）=A给药组/A空白组×100﹪。以上实验重复3次，每次做8个平行复孔。

2.平板克隆实验观察EE-JXY对Hep3B肝癌细胞克隆形成的影响：以200个/孔的细胞数将Hep3B细胞悬液接种在6孔板中，并轻轻转动，使细胞分散均匀，置CO2培养箱（HERAcell）中静置培养2～3周。当6孔板中出现肉眼可见的克隆时终止培养。弃去上清，用PBS洗涤一次，结晶紫染色，2 mol/L的Hcl溶解，450 nm检测A。

3.流式细胞仪检测SP细胞比例：消化干预后的人肝癌细胞Hep3B，重悬于37℃预热的含2﹪FBS的高糖DMEM培养基中，制备成单细胞悬液，调整浓度为1×106个/ml。每1 ml加入终浓度为5 μg/ml的Hoechst 33342染料。同时做一管对照管，即加入Hoechst 33342染料的同时加入终浓度为50 μmol/L的Verapamil。两管同时置于37℃水浴摇床中避光振荡90 min，孵育结束后，4℃离心弃上清液重悬于预冷的含2﹪胎牛血清的高糖DMEM培养基中，调整浓度为1× 107个/ml。上流式细胞仪（Beckman）检测前加入终浓度为2 μg/ml的PI染液用以排除死亡细胞。Hoechst 33342在紫外光源激发下发出红蓝两种不同波长荧光，蓝光用450/20滤光片检测，红光用675LP滤光片检测。

4.聚合酶链反应（PCR）检测Oct4、Nanog、Sox2、CD133、Ki67、GAPDH mRNA的表达：用Trizol一步法提取细胞总RNA并检测总RNA浓度。取1 μg总RNA与oligo（dT）混合，逆转录成cDNA。引物序列见表1。PCR扩增条件为：94℃变性30 s，58℃退火30 s，72℃延伸30 s，35个扩增循环。GAPDH作为内参照。PCR产物进行1.2﹪琼脂糖凝胶电泳，电泳条带经凝胶成像系统（Bio-rad）拍照并分析。

表1 ABCG2、GAPDH引物序列

表2 EE-JXY抑制肝癌细胞株Hep3B的增殖

五、统计学分析方法

采用SPSS 15.0统计软件进行统计，细胞存活率数据用表示，不同浓度组细胞存活率值比较采用单因素方差分析，0 mg/ml组和0.25 mg/ml组平板克隆实验吸光度值比较采用独立样本t检验，以P< 0.05为差异有统计学意义。

结 果

一、EE-JXY抑制肝癌细胞株Hep3B的增殖

随着EE-JXY给药浓度的加大和干预时间的延长，Hep3B细胞的存活率逐渐降低，药物抑制率逐渐升高，呈现出明显的剂量和时间依赖。可见EE-JXY能明显抑制肝癌细胞株Hep3B的增殖（表2）。

二、EE-JXY抑制肝癌细胞Hep3B的克隆形成

与0 mg/ml组比较，0.25 mg/ml的EE-JXY组克隆数明显减少，A450nm值显著下降（从0.45±0.06下降至0.29±0.03，P< 0.05），说明给药后细胞增殖能力明显下降，细胞存活率减低，与MTT结果一致（图1，2）。

图1 EE-JXY抑制肝癌细胞Hep3B的克隆形成

三、EE-JXY对Hep3B细胞中SP含量的影响（图3）

通过紫外激发检测双波长为450 nm的蓝光和675 nm的红光后，流式细胞图上显示在主群细胞的左下方有一群数目很少的细胞群（图3a）。当加入Verapamil时，这群细胞几乎消失不见（图3b）。此细胞群即为SP细胞。当EE-JXY干预Hep3B 24 h后，SP细胞含量从2.27﹪下降至0.8﹪，下降明显（图3c），可见EE-JXY可以显著降低SP细胞的比例。

四、EE-JXY抑制肝癌细胞株Hep3B干细胞相关因子mRNA的表达

与0 mg/ml组 相 比，0.25 mg/ml组Oct4，Nanog，Sox2和CD133 mRNA表达水平均有下降，说明EE-JXY能够抑制Oct4，Nanog，Sox2和CD133 mRNA的表达，干扰肝癌干细胞自我更新的能力（图4）。

图2 2 mmol/L HCl溶解经结晶紫染色后的克隆，450 nm波长读取吸光值，与0 mg/ml组比较，*P< 0.05

图3 EE-JXY对Hep3B细胞中SP含量的影响

图4 EE-JXY抑制肝癌细胞株Hep3B干细胞相关因子mRNA的表达

讨 论

研究表明，肿瘤的复发和转移是因为肿瘤组织中极少数的一群未分化的肿瘤细胞增殖的结果[4]。这群细胞因具有无限增殖、不断自我更新等干细胞样特性，被称为肿瘤干细胞（cancer stem cells，CSC）[5]。正是这群细胞的存在，使得肿瘤细胞保留了无限增殖、异常自我更新及高致瘤力和化疗抵抗的能力，是肿瘤复发转移的重要原因之一。

2006年日本学者Chiba等[6]在Huh7和PLC/PRF/5肝癌细胞株中成功分离出肿瘤侧群细胞（side population cells，SP）。这群SP具有与CSC相类似的生物学特征[7-8]，可作为研究肝癌干细胞的重要手段和治疗肿瘤的一个研究靶点。除了SP可作为研究CSC的一个重要手段，CD133也是CSC特异性表达的分子。CD133最早发现存在于造血干细胞中，后来发现其与CSC关系密切。CD133+的肝癌细胞较CD133-细胞有更强的集落形成和成瘤能力以及更强的化疗抵抗力[9-10]，极可能是治疗肝癌的另一个有效靶点。Oct4是胚胎干细胞的特异性基因，能使胚胎干细胞维持在未分化状态。若细胞发生分化，Oct4的表达就会下调甚至是消失[11]。Chen等[12]发现Oct4在CD133+肺癌细胞中高表达，沉默Oct4 mRNA后CD133+肺癌细胞分化为CD133-细胞，其侵袭力、集落形成能力等均下降。与Oct4一样，Sox2基因也在维持胚胎干细胞分化潜能上起着重要作用。Sox2与Oct4可联合控制Nanog调节细胞的多能性[13]。Nanog是一个新发现的基因，在许多未分化细胞中均有表达，如胚胎生殖细胞、畸胎瘤细胞、胚胎干细胞等[14-15]，而在已分化细胞中尚未检出Nanog的表达。它的表达调控与肿瘤耐药及复发转移有关。鉴于Oct4，Nanog，Sox2和CD133均是维持CSC自我更新和多向分化的关键因子，在目前尚未找到特异的肝癌CSC标志物的前提下，认为Oct4，nanog，Sox2和CD133是肝癌干细胞较好的标志。

研究发现中药在逆转CSC化疗耐药，控制肿瘤复发转移方面有着独到的功效。中药β-榄香烯能够抑制乳腺癌耐阿霉素细胞株MCF-7/ADM中CSC的比例和成球率，抑制乳腺癌耐药蛋白（BCRP）和P-糖蛋白（P-gP）的表达，降低阿霉素耐药几率[16]。在前期的基础研究中发现解毒消癥饮能够降低由于小剂量氟尿嘧啶诱导的Oct4与ATP结合盒转运蛋白G2（ABCG2）mRNA水平的升高及SP细胞比例的增加，从而降低氟尿嘧啶对肝癌Huh7细胞的化疗抵抗[3]。由此我们认为解毒消癥饮可能是通过破坏肝癌CSC正常自我更新和分化的平衡，进而调控肝癌细胞的衰老和增殖，发挥控制肝癌复发和转移的作用。因此本文通过考察与CSC自我更新和分化密切相关的Oct4，Nanog，Sox2和CD133 mRNA的表达，进一步阐明解毒消癥饮破坏CSC正常自我更新和分化平衡的作用机制。

文中MTT和平板克隆形成实验显示，经EEJXY干预后Hep3B细胞不仅存活率减低，而且形成的克隆数显著减少，说明EE-JXY显著抑制Hep3B细胞的增殖能力。流式细胞术分析Hep3B细胞中SP的百分含量后发现，Hep3B细胞含有少量的SP细胞，而经EE-JXY干预后，这群细胞几乎消失不见，说明EE-JXY具有抑制SP细胞增殖和自我更新的能力，这与之前对Huh7 中SP细胞的研究相符[3]。本研究在对Oct4，Nanog，Sox2和CD133基因做了检测后显示，在经过EE-JXY的干预后，Oct4，Nanog，Sox2和CD133 mRNA的表达水平均有下降，说明EE-JXY能够抑制CSC的自我更新，并可能诱导了CSC向已分化细胞的转变，这可能是造成SP细胞比例减少的原因之一，也是EE-JXY降低Hep3B细胞克隆形成能力的原因之一。本研究从SP和干性基因的方面证实了EE-JXY具有抑制CSC自我更新的作用，为JXY防治肝癌复发转移的理论提供可靠的实验依据。

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Effect of Jiedu Xiaozheng Yin on expression of cancer stem cells-associated genes in human hepatoma hep3B cell line

Chen Xuzheng,Li Jinnong,Hu Haixia,Wei Lihui,Liao Lianming,Du Jian.Academy of Integrative Medicine,Fujian University of Traditional Chinese Medicine,Fuzhou 350122,China

LIAO Lianming,Email:llm@fjtcm.edu.cn; DU Jian,Email:dujian@ fjtcm.edu.cn

ObjectiveTo investigate the effect of Jiedu Xiaozheng Yin on proliferation of Hep3B cell line,and explore the underlying mechanism from the aspect of cancer stem cells.Method Ethyl acetate extraction from Jiedu Xiaozheng Yin (EE-JXY) was prepared.Hep3B cells were cultured for 24 h in the present or absence of EE-JXY.The cell viability and colony formation capacity were measured by MTT and flat colony formation assay,respectively.The percentage of side population (SP) cells was analyzed by a flow cytometer.The mRNA levels of CD133,Oct4,Nanog and Sox2 were examined using reverse transcription PCR.ResultsCompared with control group,the cell viability,colony formation capacity and the percentage of SP cells of Hep3B cells in EE-JXY group all decreased remarkably.And the mRNA levels of CD133,Oct4,Nanog and Sox2 were downregulated.ConclusionEE-JXY remarkably inhibited the proliferation of Hep3B cells via inhibiting CD133,Oct4,Nanog and Sox2 mRNA expression and decreasing the proportion of SP cells of liver cancer.

Jiedu Xiaozheng Yin；Liver neoplasm；Stem cell

2013-12-18）

（本文编辑：李少婷）

10.3877/cma.j.issn.2095-1221.2014.03.008

国家自然科学基金项目（81102582），福建省自然科学基金项目（2013J01335）

350122 福州，福建中医药大学中西医结合研究院肿瘤研究所（陈旭征、胡海霞、魏丽慧、廖联明、杜建），药学院（黎金浓）

廖联明，Email:llm@fjtcm.edu.cn；杜建，Email:dujian@fjtcm.edu.cn

陈旭征,黎金浓,胡海霞,等.解毒消癥饮对肝癌侧群细胞增殖和相关因子表达的影响[J/CD].中华细胞与干细胞杂志:电子版,2014,4(3):195-200.