三七总皂苷脉冲迟释片体外释放度影响因素研究

奚 炜 ，胡熙曦 ，陈进兵 ，金桂兰，邢翔飞，黄久华

(1．三峡大学人民医院·湖北省宜昌市第一人民医院药剂科，湖北 宜昌 443000；2．湖北省枝江市人民医院药剂科，湖北 枝江 443200)

脉冲式给药系统又称定时给药系统（TCDDS）或控制突释系统（controlled explosion systems）[1]，是依据时间药理学及时辰药代动力学原理，定时释放有效剂量药物的新剂型，它可根据某些疾病的生物节律性特点，定时定量释药，其应用降低了耐受性和不良反应，提高了治疗的顺应性[2]。三七总皂苷作为中药三七中提取的活性有效成分，目前主要应用于心脑血管系统疾病和中枢神经系统疾病[3]。许多心血管疾病如高血压、缺血性心脏病、心绞痛等都具有明显的昼夜节律性，多为夜发性和晨发性疾病，故有必要研制在临睡前服药而凌晨释药的脉冲迟释制剂，用以该类疾病的预防与治疗。本研究中制备的三七总皂苷脉冲迟释片，在体外释放过程中延迟4～5 h后，快速脉冲式地释药，这对心血管疾病的预防与治疗有着重要意义，为以安全、合理、高效用药为指导原则的心血管疾病药物的研发提供了理论依据。

1 仪器与试药

Agilent 1200LC型高效液相色谱仪，包括G1310A单元泵、G1312A二元泵、G1311A四元泵，G1316A型柱温箱，G1314A VWD型检测器，G1362A型示差检测器，Agilent Technologies ChemStation；UV －1700型紫外分光光度计（Shimadzu）；BP211D 型十万分之一电子天平（Satorius）；TDP型单冲压片机（上海天祥健台制药机械有限公司）；ZRS－8G型智能药物溶出仪（天津大学精密仪器厂）；SK2200H型超声波清洗器（上海科导超声仪器有限公司）。三七总皂苷（昌宁德康生物科技有限公司，批号为100208）；人参皂苷Rg1对照品（中国药品生物制品检定所，批号为110703 － 201027）；羟丙甲纤维素（HPMC）、微晶纤维素（MCC）、羧甲基淀粉钠（CMS － Na）、纤维素羧甲基醚（CCNa）、乳糖、硬脂酸镁等均为药用规格；乙腈、甲醇均为色谱纯，水为二次蒸馏水，其余试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 三七总皂苷脉冲迟释片的制备

2．1．1 制剂处方

片芯处方（每片150 mg）：三七总皂苷100 mg，羧甲基淀粉钠6 mg，纤维素羧甲基醚 6 mg，乳糖 38 mg，硬脂酸镁 0．5%。

包衣处方（每片 350 mg）：HPMC（50 mPa·s）143 mg，HPMC（15 mPa·s）90 mg，乳糖 35 mg，MCC 82 mg，硬脂酸镁 0．5% 。

2．1．2 片芯制备

将主药过100目筛，按处方量称取各片芯辅料，分别过100目筛，将三七总皂苷和辅料依次加入研钵中研磨，充分混匀，于单冲压片机上压制成片重约150 mg的片芯。

2．1．3 脉冲迟释片制备

将外包衣层辅料过100目筛混匀，用75%乙醇制软材，过20目筛制粒，于60℃干燥后，过24目筛整粒，加入0．5%硬脂酸镁后混匀；按每份175 mg进行称取，将1份外衣层颗粒填入冲模内，将片心置于冲模中心，再填入另1份外衣层颗粒，于单冲压片机上压制成直径10 mm、片重约500 mg的三七总皂苷脉冲迟释片，每片含三七总皂苷100 mg。

2．2 体外释放度测定方法的建立

2．2．1 测定波长选择

精密称取人参皂苷 Rg1对照品适量，分别用 0．1 mol／L盐酸、pH＝6．8的磷酸盐缓冲液和蒸馏水溶解并稀释成适宜浓度的溶液，再分别以各自溶剂为空白，经0．45 μm微孔滤膜过滤后于200～400 nm波长范围内进行紫外扫描。同时，将辅料按处方量比例用同法稀释，经0．45 μm微孔滤膜过滤后进行紫外扫描。结果表明，人参皂苷 Rg1分别在 0．1 mol／L盐酸、pH ＝6．8的磷酸盐缓冲液和蒸馏水的介质中，在200～210 nm波长范围内呈末端吸收，各辅料在此波长处均无吸收；根据吸收最大、流动相干扰最小原则，结合2010年版《中国药典(一部)》[4]的方法，选用203 nm为测定波长。

2．2．2 标准曲线绘制

精密量取人参皂苷Rg1对照品溶液适量，为了模拟人体内环境的 pH，分别用 0．1 mol／L盐酸、pH＝6．8的磷酸盐缓冲液和蒸馏水溶解并配制成质量浓度分别为 2．9，5．8，11．6，23．2，46．4 μg／mL 的标准溶液，以色谱峰峰面积为纵坐标（Y）、人参皂苷Rg1质量浓度（μg／mL，X）为横坐标进行线性回归。各线性方程分别为：0．1 mol／L 盐酸， A＝5．109 1 C ＋13．338， r＝0．999 9；pH ＝6．8的磷酸盐缓冲液，A＝5．149 1 C ＋13．3，r＝0．999 9；蒸馏水，A＝5．122 7 C ＋13．154，r＝0．999 9。结果表明，人参皂苷Rg1在 3 种介质中，其质量浓度在 2．9 ～ 46．4 μg／mL 范围内与峰面积线性关系均较好。

2．2．3 稳定性试验

精密称取人参皂苷Rg1对照品适量及等量处方比例辅料，分别以0．1 mol／L盐酸、pH＝6．8的磷酸盐缓冲液和蒸馏水为溶剂配制成高、中、低3个质量浓度的溶液各3份，在37℃条件下保温 24 h，分别于 0，2，6，12，24 h 定时取样 20 μL，注入高效液相色谱仪，测定其峰面积。结果人参皂苷 Rg1在0．1 mol／L盐酸溶液、pH＝6．8的磷酸盐缓冲液和水溶液中测定结果的 RSD分别为0．92% ，1．25% ，1．53% ，表明 24 h 内人参皂苷 Rg1在 37 ℃ 的上述3种介质中的含量无明显变化。

2．2．4 体外释放度的测定方法

按2010年版《中国药典（二部）》附录ⅩC释放度测定法第一法操作[5]，以900 mL经脱气处理的 pH＝6．8的磷酸盐缓冲液为溶出介质，转速为 100 r／min，温度为（37 ± 0．5）℃。在预定时间间隔内取样5 mL，并及时补加等体积同温新鲜介质。样品液根据需要浓缩，用 0．45 μm 微孔滤膜过滤，取续滤液 10 μL，进样测定其峰面积，带入标准曲线计算人参皂苷Rg1的浓度，求出三七总皂苷的累积释放百分率 Q。

2．2．5 脉冲迟释片体外释放度的评价

体外释放参数与释放取样点的确定：脉冲释药最关键的指标是释药时滞和释药完全的时间，本研究以药物释放后累积释药量在 10%左右时的时间点为表观释药时滞（t0．1），以药物释放在90%左右时的时间（t0．9）代表药物完全释放的时间。分别考察4．5，5．5，6．5 h 三七总皂苷累积释放百分率，4．5 h 累积释放百分率（ Q4．5）以 10% 为标准，5．5 h 累积释放百分率（ Q5．5）以 50% 为标准，6．5 h 累积释放百分率（ Q6．5）以 90% 为标准[6]。

体外释放度的评价方法：固体药物制剂的累积释放度曲线反映了其体外的释药趋势，通过对比不同批次制剂之间的累积释放曲线，可以判断处方组成、工艺参数、释放条件等因素对药物释放情况的影响程度。本研究采用相似因子法（f2因子法）来进行处方优化、评价批间重现性。相似因子 f2的计算方法如下。

式中，Rt为 t时间参比制剂的释放度；Tt为t时间试验制剂的释放度；n为取样点的个数。f2实际上量度了2条累积释放曲线之间累积释放百分率的相似性。f2越大，表明2条体外释放曲线差异越小，如果50≤f2≤100，可认为2种制剂的释放度曲线相似。

2．3 体外释放度的影响因素考察

2．3．1 溶出介质 pH

按同一处方量制备三七总皂苷脉冲迟释片，分别以0．1 mol／L盐酸、pH＝6．8的磷酸盐缓冲液、蒸馏水为溶出介质，测定其三七总皂苷的累积释放百分率，考察不同溶出介质pH对药物释放的影响。累积释药曲线见图1 A。经相似因子法计算，结果表明，不同pH溶出介质中，该脉冲迟释片的释药趋势基本相同；为简化操作，并模拟人体肠液的内环境，本研究均以pH＝6．8的磷酸盐缓冲液为溶出介质进行处方筛选。

2．3．2 溶出方法

按同一处方量制备三七总皂苷脉冲迟释片，以pH＝6．8的磷酸盐缓冲液 900 mL为溶出介质，控制温度在（37±0．5）℃，调整转速为100 r／min，分别采用桨法和转篮法进行体外释药试验，考察其对药物释放的影响，测定三七总皂苷的累积释放百分率。累积释药曲线见图1 B。经相似因子法计算，结果表明，不同溶出方法下脉冲迟释片的释药趋势基本相同，但用浆法发现药片容易上浮，偶尔有药片与容器壁撞击发生裂片造成试验失败。为了试验过程的稳定性，本研究均采用转篮法进行试验。

2．3．3 转速

按同一处方量制备三七总皂苷脉冲迟释片，以新鲜经脱气处理的pH＝6．8的磷酸盐缓冲液900 mL为溶出介质，控制温度在（37 ± 0．5）℃，采用转篮法，考察转速分别为 50，75，100 r／min 时药物的释放情况，测定三七总皂苷的累积释放百分率。累积释药曲线见图1 C。经直观比较法[7]分析，结果表明，转速分别为50，75，100 r／min时，脉冲迟释片的释药时滞基本相同，但药物的释放速度略有不同，转速越快，药物完全释放的时间越短。为了使药物在时滞后能迅速释放，本研究均采用100 r／min的转速进行试验。

2．3．4 溶出介质黏度

公摊面积动辄再收服务费惹民怨。公摊收益被物业“代持”，但物业费、供暖费、停车费等与公摊密切相关的五花八门收费却每每如期而至，让业主们有种说不出来的“憋屈”。

按同一处方量制备三七总皂苷脉冲迟释片，以新鲜经脱气处理的蒸馏水，0．5%，1%的HPMC水溶液为溶出介质，测定三七总皂苷的累积释放百分率。累积释药曲线见图1 D，可见，溶出介质黏度对药物释放速度有一定影响，溶出介质黏度越小，释药时滞越短，水向片芯内渗透的速度越快，使药物完全释放的时间越短。2．4 脉冲迟释片最佳测定条件下释放度的重现性评价

图1 不同溶出条件下药物累积释放曲线

在100 r／min的转速下，以 pH＝6．8的磷酸盐缓冲液为溶出介质，采用转篮法，对3批三七总皂苷脉冲迟释片测定人参皂苷Rg1的累积释放百分率，并用相似因子法计算 f2值来评价释药曲线，考察其释药行为的重现性。累积释药曲线见图2。试验结果表明，3批脉冲迟释片的释药曲线无显著性差异。第1批与第2批相比，f2＝95．48；第 2批与第 3批相比，f2＝99．70；第 1批与第 3批相比，f2＝95．14；相似因子 f2均大于50，所以不同批次脉冲迟释片的释药时滞和释药速率均无显著性差异，重现性良好。符合脉冲迟释系统的释药要求。

图2 3批三七总皂苷脉冲迟释片中药物累积释放曲线

3 讨论

本研究中脉冲控释片的片芯采用粉末直接压片法[8]制得，增加了药物的崩解性和溶出度，使制得片芯在释药阶段的释药速率提高，符合该脉冲控释制剂突释药物的研究目的。脉冲控释片的制备采用包衣控释法，便于包衣层厚度的控制，迟释效果较好。该制剂在体外释放过程中延迟大约4～5 h后，快速脉冲式地释药。

三七总皂苷含有人参皂苷 Rb1，Rb2，Rc，Rd，Re，Rf，Rg1，Rg2，Rh1及三七皂苷 R1，R2，R3，R4等 20多种皂苷成分，利用高效液相色谱（HPLC）法分析测定三七总皂苷各成分时非常耗时。人参皂苷Rg1是三七总皂苷的代表性成分，根据实际情况仅以人参皂苷Rg1为测定指标进行释放度的研究。

在 UV－1700紫外分光光度计上[9]，以乙腈 －水（20∶80）为溶剂，测得人参皂苷 Rg1在200～400 nm波长范围内的吸收曲线，其在200～210 nm波长范围内呈末端吸收；根据吸收最大、流动相干扰最小原则，确定203 nm为检测波长。

固体制剂的主药成分，尤其是难溶性的主药成分，它的释放和溶解直接影响主药的吸收速率和程度。因此，测定释放度在一定程度上可间接反映药物在体内被吸收的情况。释放度是评价药物体外释药效果的重要指标，研究中药固体制剂释放度对于新药研制、剂型选择、探讨药物体内外相关性、预测药物体内过程、控制产品质量、优选处方和工艺改进及合理用药都具有重要的现实意义。通常测定中药固体制剂释放度指标有分光光度法和色谱法2种，但中药（单方或复方）制剂成分复杂，用分光光度法所得测定结果易受其他成分的干扰，大大降低了仪器的灵敏度和结果的准确性。综合考虑，本研究中采用分离度和准确度均较高的HPLC法来测定释放液中三七总皂苷的累积释放百分率，使之能够准确表示被测成分的释放情况，以此评价释放状况并筛选处方。

由于制备的脉冲迟释片经4～5 h的时滞后才开始释药，此时制剂应进入小肠部位。为了更好地模拟脉冲迟释片在体内的真实释药环境，同时考虑到药物的漏槽条件，故选取pH＝6．8的磷酸盐缓冲液为释药介质。

参考文献：

[1]吴 芳，张志荣 ．定时脉冲释药系统[J]．药学进展，2001，25(5):280－283．

[2]张 静，平其能 ．口服择时释药系统[J]．药学进展，1999，23（5）：23－26．

[3]匡玉霞．心血管疾病的昼夜节律和时辰给药[J]．中国药师，2010，23(6)：25 － 26．

[4]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010:369－370．

[5]国家药典委员会．中华人民共和国药典（二部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010:85－87．

[6]李素娟．复方丹参片脉冲控释片的制备工艺及体内外释药特性的研究[D]．武汉：湖北中医药大学，2009:28－33．

[7]Liu X，Lin Y，Yu LR．Study on Xiaojin cinnabar floated sustained release preparation[J]．Chin Tradit Pat Med，2009，23(2):87 － 89．

[8]干国平，江 维，张义生，等．三七镇痛膏质量标准的研究[J]．湖北中医学院学报，2006，8（4）：25 －26．

[9]李发美 ．分析化学[M]．第 5版 ．北京：人民卫生出版社，2006：432－436．