端粒酶逆转录酶在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

谢学成邱海汤帆葛莲英覃宇周作者单位：5300 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院胃肠外科；广西医科大学研究生学院；广西医科大学附属肿瘤医院内镜室

临床研究

端粒酶逆转录酶在结直肠癌组织中的表达及其临床意义

谢学成1邱海1汤帆1葛莲英2覃宇周
作者单位：530021 南宁 广西医科大学附属肿瘤医院胃肠外科；1广西医科大学研究生学院；2广西医科大学附属肿瘤医院内镜室

目的 探讨端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）在结直肠癌（colorectal cancer，CRC）和相应正常组织中mRNA的表达，分析hTERT mRNA与结直肠癌患者临床病理参数及预后的关系。方法 以实时荧光定量PCR（quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR）法检测42例结直肠癌组织及其相应正常组织中hTERT mRNA的表达，分析其与临床病理参数之间的关系，并结合临床随访资料分析其与结直肠癌患者预后的关系。结果 hTERT mRNA在结直肠癌组织和正常组织均可表达，但结直肠癌组织中hTERT mRNA的表达水平明显高于相应正常组织，两者差异有统计学意义（P=0.011）；在有淋巴结转移的结直肠癌中hTERT mRNA高表达率比无淋巴结转移结直肠癌明显增高（92.0%vs 52.9%，P=0.011）；在结直肠癌临床TNMⅢ期/Ⅳ期中hTERT mRNA的高表达率明显高于Ⅰ期/Ⅱ期（92.3%vs 50.0%，P=0.006）。通过Kaplan-Meier分析，结直肠癌患者hTERT mRNA的低表达组和高表达组之间的生存曲线差异具有统计学意义（P=0.014），提示hTERT mRNA的高表达可能与预后不良相关。结论 hTERT不仅在结直肠癌的发生、发展中起重要作用，而且可能促进结直肠癌的浸润、转移，有望成为结直肠癌的预后标志物及治疗靶点。

结直肠肿瘤；端粒酶逆转录酶；预后；实时荧光定量PCR

结直肠癌（colorectal cancer，CRC）发病率位居全世界所有恶性肿瘤的第三位，死亡率位居第四位，每年大约新增120万例患者，超过600 000人死亡［1］。目前普遍认为，影响CRC患者预后的主要因素为肿瘤浸润邻近器官、淋巴结转移和远处转移。研究表明，端粒酶逆转录酶（human telomerase reverse transcriptase，hTERT）在肿瘤的发生和浸润、转移中起重要作用，包括结直肠癌［2］。近年来研究发现hTERT mRNA在胃癌、子宫颈癌、乳腺癌、结直肠癌等肿瘤中的表达均呈不同程度升高，但hTERT的表达与CRC患者临床病理参数，比如分化程度、浸润深度、淋巴结转移和临床分期等之间的关系尚存在分歧［3~8］。此外，国内关于结直肠癌hTERT表达的研究存在一些不足之处，尽管蛋白水平的检测对于基因功能的研究优于转录水平，但关于hTERT的研究大部分集中在采用免疫组化半定量方法检测蛋白水平，较少针对组织基因mRNA层次，且mRNA检测方法多采用常规RT-PCR法。因此，本课题采用目前验证基因mRNA的表达更为可靠、敏感的实时荧光定量PCR（quantitative realtime polymerase chain reaction，qRT-PCR）法［9］对结直肠癌组织中hTERT mRNA的表达进行研究，结合临床病理参数及随访资料进行分析，进一步明确hTERT与结直肠癌发生、发展及预后的关系。

1 材料和方法

1.1 一般资料

收集广西医科大学附属肿瘤医院2007年至2010年42例结直肠癌手术切除标本，其中男24例，女18例，平均年龄59岁，所有病例术前均未经化疗、放疗或免疫治疗，术后均经病理检查证实。结直肠癌组织和相应的正常组织（距离肿瘤10 cm以外），获取标本后一部分立即置于液氮中速冻，然后转至-80℃超低温冰箱保存，另一部分以10%福尔马林固定，用于病理诊断。所有病例均经书信或电话随访，截止日期为2014年7月1日。

1.2 主要试剂和仪器

总RNA提取试剂盒为德国Qiagen公司，cDNA逆转录试剂盒及实时荧光定量PCR试剂盒为美国Thermo Scientific公司。hTERT基因上游引物为5′-CTCCCATTTCATCAGCAAGTTT-3′，下游引物为5′-CTTGGCTTTCAGGATGGAGTAG-3′；内参GAPDH基因上游引物为5′-GCACCGTCAAGGCTGAGAAC-3′，下游引物为5′-TGGTGAAGACGCCAGTGGA-3′（由Invitrogen公司合成）。实时荧光定量PCR仪为安捷伦Mx3005P。

1.3 方法

1.3.1 总 RNA提取 根据 Qiagen MiRNeasy Mini Kit试剂盒说明书，从结直肠癌新鲜冰冻组织中提取总RNA，以1%的琼脂糖变性凝胶电泳检测RNA的完整性，Nanodrop2000检测总RNA的质量浓度和纯度，选择OD260/280在1.8~2.1之间的样品进行下一步逆转录实验。

1.3.2 逆转录实验 按照Thermo Scientific的逆转录试剂盒，选择oligo（dT）18引物逆转录得到cDNA，反应条件如下：65℃5 min，冰浴2 min，42℃60 min，70℃5 min。

1.3.3 实时荧光定量PCR检测 按照Thermo Scientific SYBR Green qPCR Kit的说明书结合预实验，PCR反应参数设为95℃7 min，90℃10 s，60℃30 s，40个循环，结直肠癌组织和配对正常组织同时检测目的基因hTERT和内参基因GAPDH，每个样品做3个复孔。hTERT mRNA的相对表达水平RQ=2-△△Ct，以RQ>1表示hTERT mRNA的表达升高，RQ<1表示hTERT mRNA的表达降低。

1.4 统计学分析

采用SPSS 16.0统计学分析软件处理数据。计量资料的比较采用两个独立样本t检验，计数资料的比较采用χ2检验或者连续校正χ2检验；应用Kaplan-Meier分析绘制生存曲线，并采用log-rank检验比较两组生存曲线间的差异性。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 qRT-PCR检测结直肠癌组织及配对正常组织hTERT mRNA的表达情况

hTERT及内参GAPDH均为典型S型扩增曲线，溶解曲线呈单峰且溶解温度均一，没有产生明显的引物二聚体，表明引物特异性好，qRT-PCR检测结果可靠。见图1（A、B）。分析数据显示hTERT mRNA在结直肠癌组织和正常组织均可表达，但相对于正常组织，结直肠癌组织中hTERT mRNA的表达水平明显上调（P=0.011），其中，42例标本中10例hTERT mRNA在结直肠癌组织中表达下调（RQ<1），32例表达上调（RQ>1），高表达率为76.19%。见图2（A、B）。

图1 hTERT、GAPDH实时荧光定量PCR检测的结果

图2 qRT-PCR检测结直肠癌组织中hTERT mRNA表达的结果

2.2 hTERT mRNA的表达水平与结直肠癌患者临床病理参数间的关系

在有淋巴结转移的结直肠癌中hTERT mRNA的高表达率比无淋巴结转移的结直肠癌明显增高（92.0%vs 52.9%，P=0.011）；在结直肠癌临床 TNMⅢ期/Ⅳ期中hTERTmRNA的高表达率明显高于Ⅰ期/Ⅱ期（92.3%vs 50.9%，P=0.006），而hTERT mRNA的高表达与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤部位及浸润深度和远处转移之间均无关（P均>0.05）。见表1。

表1 hTERT mRNA的表达情况与结直肠癌患者临床病理参数的关系［n（%）］

2.3 hTERT mRNA的表达与结直肠癌患者总生存时间的关系

将42例患者根据临床随访所获得的信息进行生存分析，随访日期截至2014年7月1日，其中13例患者健在，27例死亡，2例失访，随访率为95.3%，通过log-rank检验发现结直肠癌患者hTERT mRNA高表达组与低表达组之间总生存期生存曲线的差异具有统计学意义（P=0.014），hTERT mRNA的高表达提示较低的总生存时间（高表达组和低表达组患者的总生存时间中位数分别是50个月和79个月）。见图3。观察表明hTERT mRNA的高表达可能降低结直肠癌患者的总生存率。

图3 hTERT mRNA的高表达组与低表达组之间结直肠癌患者的生存曲线比较

3 讨论

结直肠癌是全世界危害程度较高的恶性肿瘤之一，其致死率占所有癌症死亡的9%，早期结直肠癌经外科手术治疗后5年生存率接近85%，然而在伴有淋巴结转移的Ⅲ期结直肠癌患者，其5年生存率则不足50%［10］。因此早期、准确地诊断肿瘤的发生和转移对于改善患者的治疗及预后十分关键。近年来，端粒、端粒酶与肿瘤关系的研究越来越引起人们重视，hTERT是维持端粒酶活性的核心成分和限速步骤，其表达可以准确地测量端粒酶的活性［11］。在大多数类型肿瘤中，异常的细胞增殖和癌变都需要hTERT参与，包括结直肠癌［2］。

近年来，研究发现hTERT在结直肠癌中的表达水平呈不同程度上调，但hTERT的表达与结直肠癌临床病理参数和预后之间的关系尚存在分歧。Izgi等［5］通过qPCR检测发现hTERT在癌组织和正常组织均表达，但癌组织中hTERT mRNA的表达是正常组织的4.33倍（P<0.001），且hTERT的表达与结直肠癌临床分期、肿瘤部位、淋巴结转移及远处转移之间的差异无统计学意义。Saleh等［6］研究发现hTERT mRNA的表达与肿瘤的浸润深度、临床分期、淋巴结转移、分化程度均无关，但相比于右半结肠癌，左半结肠癌和直肠癌中hTERT的表达水平更高（P=0.029）。魏晓军等［7］采用T7 RNA聚合酶催化的荧光扩增技术（Cellular FACTT）检测结直肠癌患者外周血液循环肿瘤细胞中hTERT的表达与临床病理的关系，发现hTERT阳性检出率与TNM分期、M分期及肿瘤分化程度具有相关性（P<0.05）。而彭玉林等［8］通过qRT-PCR检测结直肠癌外周血液hTERT mRNA的表达，证明结直肠癌组hTERT的表达水平和阳性率均明显高于健康对照组（P<0.05），hTERT的表达与TNM分期和淋巴结转移明显相关（P<0.05），而与肿瘤发生部位、肿瘤大小和分化程度无相关性（P＞0.05）。

本课题采用qRT-PCR技术检测结直肠癌中hTERT mRNA的表达，qRT-PCR是一项新的技术，其敏感性和特异性均较高，且不像常规RT-PCR法需要电泳处理，避免了电泳过程中的误差，也克服了免疫组化和PCR等法只能进行定性分析的缺点，使实验结果可信度更高。

本研究结果表明hTERT mRNA在结直肠癌组织和正常组织均可表达，但结直肠癌组织中hTERT mRNA的表达水平明显高于正常组织（P=0.011）。hTERT mRNA的表达水平与结直肠癌淋巴结转移（P=0.011）及TNM分期（P=0.006）密切相关，而与患者年龄、肿瘤大小、分化程度、肿瘤部位、浸润深度、远处转移等无关，表明hTERT的表达水平随着结直肠癌患者疾病的严重程度的升高而增加。近年来关于hTERT与肿瘤预后的关系亦有报道，Gertler等［12］首先报道结直肠癌中hTERT的高表达预示患者预后较差。而Zaffaroni等［13］研究提示任何端粒酶维持机制的缺失都可能促成较为良好的预后。最近研究［14］表明，端粒酶可以作为结直肠癌患者总生存期独立的预后评价指标之一。本课题结合临床随访资料，通过Kaplan-Meier绘制生存曲线比较hTERT高表达组、低表达组之间的差异，经log-rank检验显示两曲线间差异具有统计学意义（P=0.014），表明结直肠癌患者中hTERT的高表达提示其术后生存期较短。但目前对其机制仍未十分清楚。有研究［15］发现，转染hTERT不仅可以促进肿瘤细胞的增殖，还可以增强癌细胞细胞外基质的黏附能力，促进肿瘤细胞的浸润和转移。最近研究［16］表明hTERT与癌症转移和复发的主要因素上皮-间质转化（EMT）及癌症干细胞关系密切，hTERT过表达能促进EMT和诱导癌细胞干性，从而促进肿瘤的转移和复发，而hTERT表达的小分子感染RNA消耗，则可以减少转化生长因子（TGF-β1）和β-catenin介导的EMT。

综上所述，hTERT在结直肠癌组织中表达较相应正常组织明显升高，并与结直肠癌患者淋巴结转移、TNM分期及术后生存时间密切相关，进一步明确了hTERT在结直肠癌的发生、发展及预后中起到重要作用。hTERT有望作为结直肠癌患者预后评估的一个指标之一，hTERT表达升高的结直肠癌患者应加强随访。

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［2014-08-11收稿］［2014-09-02修回］［编辑 阮萃才］

Clinical and prognostic significance of hTERT expression in patients with colorectal cancer

XIE Xue-cheng1，QIU Hai1，TANG Fan1，GE Lian-ying2，QIN Yu-zhou（Department of Gastrointestinal Oncology，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；1Graduate School of Guangxi Medical University；2Department of Endoscopy，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）

QIN Yu-zhou.E-mail：qyz402@126.com

Objective To investigate the expression profile of human telomerase reverse transcriptase（hTERT）in colorectal cancer（CRC）and to assess its clinical significance.Methods Quantitative real-time PCR was used to detect expression of hTERT mRNA both in colorectal cancer and in corresponding normal tissue.Expression data were correlated with clinicopathological features，and survival analysis was performed to assess the prognostic significance.Results The hTERT mRNA was expressed in both tumor and CRC tissue，but it was expressed at significantly higher levels in cancer tissue（P=0.011）.Upregulation of hTERT was significantly associated with lymph node involvement（P=0.011）and TNM stage（P=0.006）.Kaplan-Meier survival analysis of low vs.high expressers of hTERT revealed much lower survival among high expressers（P=0.014）.Conclusions The results of the current study suggest that hTERT may play an important role in onset of CRC，so the protein may have potential as a prognostic biomarker or even as a therapeutic target.

Colorectal neoplasm；hTERT；Prognosis；Quantitative real-time polymerase chain reaction

R735.3+5

A

1674-5671（2014）03-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.07

广西教育厅科研基金资助项目（201012MS038）

覃宇周。E-mail：qyz402@126.com