肝细胞癌根治术后早期复发相关microRNAs的筛选

姜经航郭哲杨浩洁杨富权鲍思扬黎乐群杨日荣向邦德

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科；2广西医科大学基础医学院免疫学教研室

基础研究

肝细胞癌根治术后早期复发相关microRNAs的筛选

姜经航1郭哲1杨浩洁1杨富权1鲍思扬1黎乐群1杨日荣2向邦德1

作者单位：530021 南宁1广西医科大学附属肿瘤医院肝胆外科；2广西医科大学基础医学院免疫学教研室

目的 筛选与肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）患者根治术后早期复发相关的microRNAs。方法 收集10例HCC患者肝脏组织标本，其中早期复发组5例，非早期复发组5例，以及正常肝脏组织标本4例。利用microRNA基因芯片技术检测3组肝脏组织标本中microRNAs的表达谱，筛选出差异表达的microRNAs。结果 早期复发组与正常组相比，miR-21-3p、miR-21-5p、miR-222-3p、miR-3182、miR-3651、miR-3654、miR-4451、miR-4633-5p、miR-720的表达均上调，miR-4525的表达下调（P<0.05）；非早期复发组与正常组相比，miR-106b-5p、miR-4451、miR-3651、miR-93-5p的表达均上调，miR-451a、miR-3692-5p的表达下调（P<0.05）。结论 microRNAs的表达与HCC患者术后早期复发有关，检测患者肝脏组织中microRNAs的表达水平可能有助于监测HCC术后早期复发。

肝肿瘤；microRNAs；基因芯片；复发

肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）由于发病隐匿，进展迅速，早期诊断困难，预后差，是导致患者因癌死亡的主要原因之一［1］。目前手术切除仍然是治疗HCC最有效的方法，然而术后2年复发率高达45%［2］。因此筛选出HCC术后早期复发病例中差异表达的基因，研究与HCC早期复发密切相关的分子机制十分必要。近年来，有研究表明microRNA（miR）在肿瘤凋亡、增殖和转移中发挥着类似癌基因和抑癌基因的作用［3］。本研究采用microRAN芯片技术筛选出HCC早期复发组、非早期复发组和正常组肝脏组织中差异表达的microRNAs，为进一步研究microRNAs在HCC早期复发中的分子机制提供新的线索。

1 资料与方法

表1 纳入研究患者的基线资料

1.1 临床标本

10例HCC肝脏组织标本均来自我院行根治性肝切除术的患者，术后病理诊断为HCC。其中术后2年内复发组5例（早期复发组）和2年内未复发组5例（非早期复发组），具体入组标准为：⑴单结节肝癌，肿瘤直径<5.0 cm；⑵肝功能Child-Pugh A级；⑶手术切缘＞1.0 cm；⑷术后影像学检查未见残留肿瘤、肝内外转移以及门静脉癌栓；⑸术前AFP阳性者术后随访2个月内血清AFP降至正常。正常组为4例正常肝脏组织（肝血管瘤标本周围的正常肝脏组织）。本研究经广西医科大学附属肿瘤医院医学伦理委员会批准。入组患者一般资料详见表1。

（续表）

1.2 方法

1.2.1 总RNA的提取 利用液氮研磨早期复发组、非早期复发组和正常组肝脏组织标本，采用Trizol试剂（Invitrogen公司）一步法提取3组肝脏组织的总RNA。采用NANODROP 2000（Thermo公司）核酸微量检测仪检测总RNA的纯度，1.0%琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整性。

1.2.2 microRNAs的检测 取2.5 μg总RNA用于检测早期复发组、非早期复发组和正常组肝脏组织中差异表达的microRNAs。microRNA芯片采用Human miRNA OneArray（Phalanx Biotech Group提供）检测与人类相关的microRNAs。具体实验过程由Phalanx Biotech Group实施。

1.3 数据分析

实验数据由Phalanx Biotech Group分析处理，其中以P<0.05为依据确定差异表达的microRNAs，同时以log2|Ratio|≥0.8确定上调和下调表达的microRNAs。

2 结果

2.1 总RNA的纯度和浓度

早期复发组、非早期复发组和正常组中总RNA吸光度A260/A280均在1.8~2.0之间，提示总RNA的纯度高，无DNA和蛋白质污染。1.0%琼脂糖凝胶电泳结果显示，28S和18S条带清晰，无明显拖尾现象，且28S/18S条带灰度比值>1.5，提示总RNA的完整性好。见图1。总RNA纯度和完整性检测提示总RNA质量好，可以进行后续基因芯片实验。

2.2 早期复发组、非早期复发组和正常组中microRNAs的表达

2.2.1 早期复发组与正常组中各种类型microRNAs相比，筛选出差异表达的基因，如图2。发现有9个microRNAs的表达上调，分别为 miR-21-5p、miR-3651、miR-3182、miR-21-3p、miR-3654、miR-4633-5p、miR-4451、miR-222-3p和miR-720，miR-4525的表达下调（P<0.05）。见表2。

2.2.2 非早期复发组与正常组中microRNAs相比较，筛选出差异表达基因，如图3。发现4个microRNAs的表达上调，分别为miR-106b-5p、miR-4451、miR-3651和miR-93-5p，2个microRNAs的表达下调，分别为miR-451a、miR-3692-5p（P<0.05）。见表3。

2.2.3 早期复发组与非早期复发组中各种类型microRNAs相比，筛选出差异表达的基因，如图4。均无表达上调和表达下调的microRNAs（P>0.05）。

图1 总RNA 1.0%琼脂糖凝胶电泳结果

图2 早期复发组与正常组比较差异表达的microRNAs

表2 早期复发组与正常组中表达上调和下调的microRNAs

表3 非早期复发组与正常组中表达上调和下调的microRNAs

图3 非早期复发组与正常组比较差异表达的microRNAs

图4 早期复发组与非早期复发组比较差异表达的microRNAs

3 讨论

microRNA异常表达与多种肿瘤的发生、发展密切相关，例如肝细胞癌、乳腺癌和胰腺癌等［4］。microRNA通过调控肿瘤细胞周期、凋亡、增殖和迁移，从而影响HCC的复发、转移和预后［5］。同时HCC术后复发和转移与肿瘤细胞中存在少数具有高度增殖与自我更新能力，具备多向分化潜能的肿瘤干细胞有关。

早中期HCC根治术后高复发率导致患者的预后不良，因此加强HCC患者根治术后的监测尤为重要。目前临床上主要通过患者的临床表现和病理检查结果判断HCC复发，但是HCC患者根治术后早期复发是多因素、多基因相互作用所致。基因芯片技术具有快速、平行、高效、高通量的优点，被广泛应用于研究肿瘤发生、发展过程中基因表达谱的变化，从而为肿瘤的诊断和治疗提供科学依据。本研究利用基因芯片技术在所有已发现的microRNAs中检测正常肝脏组织和早期复发、非早期复发肝癌组织中microRNAs差异表达谱，筛选与HCC根治术后早期复发相关的microRNAs。

本实验研究发现早期复发组和正常组差异表达且有统计学意义的microRNAs有10个，相对于正常组、非早期复发组中miR-21-5p和miR-3651分别上调5.06倍和3.22倍。Cut-off值是通过使用阴性测定结果均值的2倍或3倍作为阳性判断值。在对于样本数相对足够大的情况下，检测指标呈正态分布，在95.3%的阳性预测值的情况下通常取2倍作为阳性判断值，若要求得到99%的阳性预测值，则选取3倍为阳性判断值。因此通过检测HCC患者肝脏组织中miR-21和miR-3651的表达量，可能用于推断患者根治术后早期复发潜能。对于肝脏组织中miR-21和miR-3651高表达患者可以给予相应的辅助治疗以预防HCC患者根治性手术后早期复发。

miR-21已经被证实与肝癌、胃癌和乳腺癌等多种恶性肿瘤有关，并且上调的miR-21可以促进肿瘤细胞的增殖和增强肿瘤的侵袭力，同时患者术后复发率增加，无瘤生存时间缩短，恶性程度高，预后差［6］。有研究多次证实miR-21通过抑制磷酸酶及张力蛋白同源等位基因（phosphatase and tensin homolog，PTEN）和程序性细胞死亡4（programmed cell death 4，PDCD4）基因的表达调节肿瘤细胞的增殖和凋亡，通过抑制PTEN、PDCD4和新型基质金属蛋白酶抑制剂RECK（reversion inducing cysteine rich protein with Kazal motifs，RECK）的表达增强肿瘤细胞的侵袭性［7~9］。有学者［10］在对人乳腺癌MCF-7细胞研究中发现过表达miR-21有促进细胞发生上皮-间叶组织样表型转化的能力，从而使其具备肿瘤干细胞的生物学特性，导致MCF-7细胞的侵袭、转移和成瘤能力增强。在本研究中miR-21在早期复发组明显上调，可以间接认为miR-21与肝癌干细胞之间有可能存在某种关联，促使HCC术后早期复发。同时为本课题组下一步探讨miR-21、肝癌干细胞和HCC术后早期复发之间的分子机制提供一定的实验基础。有研究发现［11］miR-3651在口腔鳞癌中高表达，且表达水平与患者淋巴转移、病理分级和肿瘤分化程度有关，对患者的预后产生一定的影响。本研究中高表达的miR-3651的患者早期复发率高，因此探讨其对HCC早期复发的分子学机制十分重要。

非早期复发组相对于正常组有统计学意义的差异表达基因有6个，其中非早期复发组相对正常组的miR-451a下调了4.69倍。该结果显示，对于肝癌组织中miR-451低表达的HCC患者早期复发率低。

miR-451在非小细胞肺癌中的表达下调，限制RAS相关蛋白14的表达而发挥抑癌基因的作用，在神经胶质瘤中通过调控AMPK途径抑制肿瘤细胞的增殖和迁移，导致患者的预后不良［12，13］。通过对人结肠癌细胞系RKO、人子宫颈癌细胞Hela、人脐静脉内皮细胞转染miR-451模拟物发现，miR-451通过下调L6R基因的表达来抑制细胞的增殖、侵袭和血管生成［14］。胃癌患者术前血浆中miR-451的表达水平明显高于正常人，术后血浆中miR-451的表达水平显著下降，因此血浆中miR-451可以作为筛查和动态检测胃癌患者的标志物［15］。本研究中miR-451表达下调的患者术后早期复发率低，和Bandres等［16］学者的研究一致，该研究指出胃癌患者组织中miR-451低表达，并且其表达水平和胃癌预后呈正相关。同时miR-451在维持大肠癌肿瘤干细胞表型中起着关键作用，可以降低肿瘤干细胞致瘤性和对化疗药物的抵抗，减少自我更新［17］。本研究需要后续体内和体外实验进一步验证miR-451、肿瘤干细胞和HCC患者早期复发的关系。

本研究不足之处在于所纳入病例数较少，缺乏后续实验明确差异表达的microRNAs在临床中的意义。同时缺乏原发瘤与复发瘤之间microRNAs差异表达的microRNAs的比较，因此无法确定复发灶是单中心复发还是多中心复发，有关方面有待深入研究。

总之，本研究提示miR-21和miR-3651的高表达与HCC根治术后早期复发密切相关，为临床探讨HCC患者根治术后早期复发提供可能的分子学依据。同时，临床上对于肝组织miR-21和miR-3651高表达的患者应该高度警惕，须采取有效的辅助治疗措施以预防HCC患者根治术后早期复发；miR-451低表达者早期复发率虽低，但对于miR-451低表达者的监测也不能忽视。

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［2014-07-05收稿］［2014-08-28修回］［编辑 阮萃才］

Microarray-based screening to identify differentially expressed microRNAs associated with early recurrence of hepatocellular carcinoma after curative resection

JIANG Jing-hang1，GUO Zhe1，YANG Hao-jie1，YANG Fu-quan1，BAO Si-yang1，LI Le-qun1，YANG Ri-rong2，XIANG Bang-de1
（1Department of Hepatobiliary Surgery，Affiliated Tumor Hospital of Guangxi Medical University；2Department of Immunology，School of Preclinical Medicine，Guangxi Medical University，Nanning 530021，P.R.China）Corresponding author：XIANG Bang-de.E-mail：xiangbangde@163.com

Objective To screen for differentially expressed microRNAs associated with early recurrence of hepatocellular carcinoma（HCC）.Methods Tissue samples were taken from 10 HCC patients who had undergone curative resection，comprising 5 patients who experienced early recurrence and 5 who did not.In addition，normal tissue from 4 individuals without HCC served as control samples.All samples were analyzed using microarrays to identify microRNAs specifically expressed in early-recurrence HCC.Results Several microRNAs were significantly upregulated in early-recurrence HCC relative to normal tissue：miR-21-3p，miR-21-5p，miR-222-3p，miR-3182，miR-3651，miR-3654，miR-4451，miR-4633-5p，and miR-720.Conversely，miR-4525 was significantly downregulated in early-recurrence HCC relative to normal tissue.Relative to normal tissue，several microRNAs were significantly upregulated in nonearly-recurrence HCC（miR-106b-5p，miR-3651，miR-4451，miR-93-5p）or downregulated（miR-3692-5p，miR-451a）.Conclusion MicroRNAs may play a key role in early recurrence of HCC after curative resection.

Liver neoplasm；MicroRNAs；Genechip；Recurrence

R735.7

A

1674-5671（2014）03-06

10.3969/j.issn.1674-5671.2014.03.02

国家科技重大专项课题（2012ZX10002010001009）；国家自然科学基金资助项目（81260331；81360312）；2014年广西研究生教育创新计划资助项目（YCSZ2014108）

向邦德。E-mail：xiangbangde@163.com