多环芳烃污染土壤微生物修复技术

孙萍 高永超 张强 黄玉杰 迟建国 邱维忠 王加宁

(1.山东省科学院生物研究所,山东济南 250014；2．济南大学化学化工学院,山东济南 250022；3.山东省应用微生物重点实验室,山东济南 250014)お

摘要 微生物降解是环境中PAHs主要的降解方式。介绍了微生物的降解能力、PAHs生物可利用性、电子受体、营养物质、环境因子及植物联合等对微生物降解PAHs的影响，并且对原位处理、异位处理的修复工艺进行了简述。同时，指出今后的治理应重视污染源头控制，完善酶制剂、联合修复等有效的生物修复技术。

关键词 生物修复；多环芳烃；污染土壤

中图分类号 SB188文献标识码

A文章编号 0517-6611（2014）19-06220-04お

Research Advance on the Bioremediation of PAHs Contaminated Soil

SUN Ping, WANG Jia瞡ing et al(Biology Institute of Shandong Academy of Sciences, Jinan, Shandong 250014; School of Chemistry and Chemical Engineering, University of Jinan, Jinan, Shandong 250022)

AbstractMicrobial degradation is the major degradation process of PAHs in the environment. Influence of microbes biodegradation property, bioavailability, electron acceptor, nutrient, environmental factors, and plant to biodegradation of PAHs and the remediation technology, including in瞫itu and off site remediation, were introduced. Controlling the pollution source, enzyme remediation and combined remediation were recommended in the remediation process.

Key wordsBioremediation; Polycyclic aromatic hydrocarbons; Contaminated soils

基金项目 国家高技术研究发展计划(863)(2013AA06A210)；国家国际科技合作专项（2013DFR90540）。

ぷ髡呒蚪 孙萍（1986-），女，山东潍坊人，硕士研究生，从事土壤污染微生物修复方面的研究。*通讯作者，研究员，博士，从事环境污染生物修复研究。

收稿日期 20140530

多环芳烃(Polycyclic aromatic hydrocarbons,PAHs)是指由2个或2个以上的苯环按一定顺序排列组成的碳氢化合物，具有强烈致癌、致畸和致突变特性［1］。土壤中的PAHs 以4~6环的PAHs为主［2］。化石燃料的燃烧是PAHs的主要来源。由于人类对化石产品的不断开发利用，PAHs持续向环境中排放，高温过程形成的PAHs大都排放到大气中，随着大气环流、大洋环流等循环而不断扩散，空气、土壤及水体甚至南极、高山冰川等都受到PAHs的污染。PAHs和其他固体颗粒物等结合在一起，通过干、湿沉降转入湖泊、海洋，最终主要在沉积物、有机物质和生物体中累积，对人类健康和整个生态系统构成威胁［3］。

PAHs具有低水溶性、高亲脂性以及化学稳定性的特点，环境中去除方式主要有挥发、光降解、生物积累、化学氧化、土壤吸附和微生物降解，而微生物降解是环境中PAHs最主要的去除方式。该过程在好氧、厌氧条件下都能进行［4］。人为强化修复可以加速PAHs在环境中的降解，方法主要有物理修复、化学修复和生物修复。生物修复是通过植物、微生物实现土壤污染物的转移、消解，具有成本低、污染小、安全等优点，是修复工程中应用较广泛且相对成熟的一种技术。

1 PAHs污染土壤生物修复的影响因素

1.1 生物对PAHs的降解性能

PAHs的生物降解是酶促反应过程。加氧酶对PAHs的酶促开环是PAHs生物降解的限速步骤。不同微生物中加氧酶的表达量及催化活性差异很大，因而降解PAHs的能力不同。筛选酶活性高、对PAHs降解能力强的微生物且对其进行驯化培养非常重要。

污染土壤中的PAHs降解菌经驯化、培养、富集，然后进行分离、鉴定及降解能力测试，得到降解能力较高的菌株［5］。筛选出的菌株经发酵、固定化而制备的微生物菌剂，构建了降解PAHs的土壤微环境，能提高降解菌在土壤中的存活率且可以提高PAHs的降解效率，降解效果明显好于游离菌［6］。用现代分子生物学手段提高降解菌株PAHs降解相关酶的表达量或提高其催化活性、将不同的降解基因组装到同一微生物体内提高其降解谱［7］、利用细胞融合技术将降解菌株与表面活性剂产生菌融合而得到高效降解的融合菌［8］等，都是获得高效降解菌的有效手段，但应注意转基因微生物在环境中的应用限制。污染土壤中多种PAHs共存且常与其他的污染物混合在一起，因此构建多功能的微生物菌群，有利于促进污染物的快速降解及彻底矿化［9］，有效地防止二次污染。

1.2 PAHs生物可利用性

PAHs的低水溶性导致其在土壤中的生物可利用性较差。表面活性剂可降低土-水界面张力、减少PAHs在土壤颗粒上的吸附而提高微生物对PAHs的吸收和降解［10］。在PAHs污染土壤中投加TW80（吐温80），一段时间后土壤表面和空隙中布满微生物菌落，投加TW80的处理培养30 d后PAHs降解率均明显高于对照［11］。由此可知，TW80能提高PAHs的生物可利用性，并且提高其降解率。多数化学表面活性剂都具有生物毒性，大量使用后会引起土壤表面活性剂污染，而有些微生物在降解PAHs过程中能产生糖脂形式的生物表面活性剂［12］，乳化能力高于化学活性剂且不产生二次污染，因而比化学活性剂更安全、有效。为提高PAHs的降解效率，可利用现代生物技术赋予PAHs降解菌产表面活性剂的能力，或在修复过程中同时投加能产生表面活性剂的微生物。

1.3 电子受体

有机污染物在土壤环境中的降解是生物参与的氧化还原过程，在此过程中有机物为电子供体。微生物脱掉有机物上的电子，经电子传递链传递给电子受体，并且释放能量供微生物生长代谢。如果电子受体缺失，则将会导致电子传递的终止而影响生物对有机污染物的氧化降解，因此土壤中电子受体的种类、浓度直接影响PAHs的降解速度。好氧和厌氧环境中微生物对PAHs的降解途径不同［13］。好氧降解以O2作为电子受体，修复时可向污染土壤通气供氧或添加供氧剂（如H2O2）；在厌氧条件下，以NO3-、NO2-、SO42-等含氧酸根作为电子受体进行反硝化、硫酸盐还原发酵和产甲烷反应，实际应用时可添加此类电子受体［14］。好氧条件下的生物降解是PAHs的主要降解形式。因此，修复过程中通过强制通风的方式保证O2的供给是PAHs污染土壤修复过程中的重要措施。

1.4 营养物质

添加易于被微生物利用的C源，改善土壤环境中营养条件，可以促进PAHs降解微生物的增殖，提高微生物活性且促进对污染物的降解［15］。营养物质的比例平衡对微生物的生长繁殖非常重要，特别是用于合成细胞物质的大量元素，如比例失调会严重影响微生物细胞物质合成，降低微生物在环境中的密度，从而影响对污染物的分解效率。一般有机污染土壤中C元素含量较高，而N、P相对不足，人为调整土壤中有效碳、氮、磷的比例为100∶10∶1左右有利于有机污染物的降解［16］。在向PAHs污染土壤添加 N、P 等营养物时，需确定土壤中各种营养盐的有效浓度。根据微生物种类、修复方式，通过实验确定最佳的营养物浓度。微生物对污染土壤的修复是一个相对缓慢的过程，持续时间较长，因此在修复过程中要跟踪检测土壤中碳氮磷比例的变化，并进行补加，以防止因碳氮磷的比例改变而导致修复后期修复效果的下降。

1.5 环境因子

环境温度、pH、土壤理化性质等因素也影响土壤中PAHs的降解。温度对微生物降解 PAHs 的影响主要表现在它对微生物代谢活性、PAHs理化性质等方面的影响。不同微生物最适生长温度、pH不同，多数微生物在20~40 ℃范围内酶活性较高，对PAHs降解较快，而且在中性pH下活性较强，强酸或强碱条件下对PAHs的降解会受到明显的抑制［17］。有些微生物能适应强酸或强碱极端环境［18］。筛选能适应极端环境的PAHs降解微生物或将相关基因克隆进PAHs降解菌可用于极端环境下的土壤修复。

2 修复工艺及应用

根据污染土壤的处置地点，微生物修复工艺可分为原位修复和异位修复。在实际修复过程中，可根据场地及污染物特征等因素选择适合的修复技术。

2.1 原位修复 原位生物修复指不移动受污染的土壤，直接向污染的土壤中投加营养物质、供氧剂、电子受体、表面活性剂以及高效降解菌等，通过促进微生物的代谢活性来降解污染物的修复方式。原位修复技术不需要移动受污染土壤，不需要复杂的处理设备，具有操作简便、成本低、对周围环境影响小等优点，易于大面积推广使用。按工艺技术特点进行分类，原位修复主要有生物通风法、投菌法、生物培养法、土耕法等。

2.1.1 生物通风法。生物通风法是在污染的土壤中打几眼深井，安装鼓风机和抽真空机，将空气强行压入土壤中，然后抽出，此过程中挥发性有机物随之去除。通入空气可以提高土壤中氧气浓度，有利于提高微生物对PAHs的降解活性。在通入空气时，可加入一定量的氨气，为土壤中的降解菌提供所需要的氮源来促进降解菌的生长繁殖。这种通风技术适合多孔的土壤结构［19］，而地下水位高地区不宜使用。

2.1.2 投菌法。也称生物强化法，就是直接向污染土壤中投加外源降解菌，同时提供这些降解菌生长繁殖所必需的营养物质。在自然条件下，降解PAHs的土著菌数量少、活性低。修复过程中将从污染环境中筛选驯化或利用基因工程获得的高效降解菌培养后以较高的密度投加到污染土壤中，可增强修复效果。Juhasz等［20］用筛选出的菌株修复PAHs污染土壤，经修复后土壤中PAHs各组分含量均明显降低，尤其是3环、4环、5环以及7环的PAHs降解效果显著。由于PAHs常以多种组分共存，其生物降解过程涉及多种微生物和酶，导入单一的微生物难以对所有PAHs取得良好效果。因此，在实际应用中，可考虑投加多种高效降解菌组成的复合菌群，但外源菌应与土著菌有良好的相容性。

2.1.3 生物培养法。也称生物刺激法。该方法是定期地向污染土壤中投加适量的菌体生长所需的营养物质以及电子受体，刺激土著PAHs降解微生物繁殖，并提供有利的降解环境以促进降解。土著菌经长期自然驯化，适应污染场地污染物浓度及种类，形成降解污染物的共生菌群，比外源添加的微生物具有更高的降解活性。Kaempfer等［21］向石油污染土壤中投加适量的N、P等营养元素和NO3-、O2及H2O2等电子受体，2 d后PAHs降解菌浓度显著增加。生物刺激法可使降解速率提高2~3倍［22］，增强土著菌的活性。这是提高土壤中PAHs降解效率的有效途径［23］。

2.1.4 土耕法。该方法是对污染土壤进行耕耙、施肥、灌溉，并且加入石灰，使得污染土壤充分与降解菌混合，为微生物尽可能提供一个良好的环境。该方法适用于土壤渗滤性较差、污染土层较浅的场地，由于操作方便、工艺简单而处理成本较低。在利用土耕法修复石油污染土壤时，一年半后发现80%石油烃被降解，土耕法对土壤结构破坏较小、操作简单、费用低，不足是污染物可能从土壤迁移且处理周期┙铣ぁ＊

2.1.5 植物修复。该方法是利用植物来降解或移除土壤中有机污染物的修复方式。机理包括植物对污染物的吸附、吸收、转移、降解、固定、挥发等。植物与微生物组成复合体系中微生物和植物形成互惠共生体［23-25］。植物在吸收和矿化土壤中PAHs的同时，植物根际作用增加了PAHs降解菌的数量，而且植物分泌的有机物为微生物共代谢提供了基质底物，两者共同作用可有效提高污染物的降解效率。玉米对多环芳烃芘污染土壤的修复结果显示，植物吸收不是多环芳烃去除的主要机理。种植玉米增强了土壤中脱氢酶和脲酶等酶活性,促进了植物-根圈微生物体系对芘的生物降解［25］。

2.1.6 酶修复。PAHs污染土壤的微生物修复是微生物的酶促降解过程，提取微生物的胞内酶直接进行污染土壤修复，加速修复进程。相对于微生物修复，酶修复所受土壤环境因子的限制较小、对微生物间的竞争不敏感、即使在PAHs浓度很低时酶也有较高的催化降解活性。然而，从微生物胞内对酶的提取耗能较高，造成修复成本较高。同时，高效降解PAHs酶制剂的制备、酶修复过程的机理以及影响因子、最佳工艺等需进一步研究［26］。另外，酶制剂对PAHs等污染物的催化降解速率虽然较快，但在环境中的活性保留时间较短，因此在实际修复过程中，需要与微生物修复进行联合。

2.2 异位修复

异位生物修复是将污染土壤转挖出并移到另一个地方进行修复。该技术能有效缩短修复时间、控制修复效果，但成本高、生态环境易被破坏，广泛应用受到一定的限制。异位修复工艺主要包括预制床法、生物反应器法、土壤堆肥法。

2.2.1 预制床法。在一平台上铺上砂石，把污染土壤以20 cm左右的厚度平铺到预制床上，投入适量微生物生长繁殖所需要的营养物质、水等，定期翻耕补充氧气。预制床设有滤液收集和控制排放系统，可使得污染土壤的迁移量最少。与同一区域的原位修复方法相比，预制床法对3环及以上的PAHs的降解效率明显提高。有研究表明，当污染土壤中总石油烃含量为25.8~77.2 g/kg时，预制床法降解53 d，总石油烃降解去除率达60%左右，PAHs的去除率为32.86%~44.73%［27］。

2.2.2 生物反应器法。也称为生物泥浆法，是将污染土壤移到反应器内，然后加入3~9倍的水，搅拌使其呈泥浆状，加入营养物质、表面活性剂和电子受体等，通入空气的同时剧烈搅拌，使得微生物与有机污染物充分接触，降解一定时间后泥浆快速过滤脱水。生物反应器法降解PAHs以水相为处理介质，使污染土壤与微生物及其他添加物充分接触混合均匀，且避免复杂多变的自然环境对修复的影响，PAHs的生物降解速度比其他生物处理过程更快。但是，该法的运行成本较高，仅适合小范围的污染土壤修复。Robert等［28］在生物反应器中投入白腐真菌修复PAHs污染的土壤，处理36 d后相对分子量低的PAHs的降解率达到70％~100％，相对分子量高的PAHs的降解率为6％~50%。

2.2.3 土壤堆肥法。也叫生物堆制法、堆腐法，是将受污染的土壤挖掘出来，运输到处理场地，加入干草、树叶、木屑、麦秆、草炭、锯屑及肥料等土壤调理剂以提供微生物生长的营养，并且用石灰调节其pH，为微生物的生长代谢提供良好的环境以促进污染物的降解。生物堆处理污染土壤时有较高的效率。毛丽华等［29］应用生物堆肥法修复油田污染土壤，40 d后原油去除率达45%。生物堆肥法可提高土壤的渗透性，改善土壤质量，缩短污染土壤的修复时间。

2.2.4 厌氧处理。在生物反应器处理时不通入空气，可以创造一个相对厌氧的环境，利用厌氧降解菌进行厌氧处理，也可以取得良好的处理效果［30］，但是由于厌氧反应器的异位处理成本高，不适合大面积的土壤污染处理。土壤和沉积物中多为缺氧环境，为厌氧处理提供便利条件，只需补充厌氧微生物生长所需的有机质、电子受体，而无需向受污染土壤中补充氧气，也无需经常翻耕，因此操作更方便、能耗更低且能防止污染物的挥发。在厌氧处理过程中，向土壤中添加硝酸盐、硫酸盐及产甲烷反应的有机质等厌氧反应的电子受体可以明显促进PAHs的厌氧降解过程，特别是添加硫酸盐的效果更显著［31-32］。

3 研究展望

PAHs污染土壤的生物修复存在修复周期较长、降解过程中形成一些毒性更大的中间产物等问题，因此需要结合植物学、微生物学、环境化学和分子生物学等多学科领域知识建立高效的PAHs污染土壤的修复体系，强化微生物对PAHs的共代谢，加强修复过程的调控，探究外源高效降解菌与土著菌稳定共存的环境条件，并且构建高效修复菌群，进一步完善植物-微生物联合修复技术，建立与其相适应的田地管理措施等，最终得到高效修复。

在完善修复工艺的同时，应注意以下方面。①减少PAHs的排放。我国工农业高速发展、化石燃料的消耗、柏油路大量铺设等都造成PAHs的大量释放、扩散。因此，应改变能源结构，减少煤炭、石油等的应用量，加强石化企业污染物的排放管理、石油制品的质量控制及燃烧后尾气的治理等，从源头杜绝污染物的外排。

②完善环境生态检测系统，建立环境风险评价机制。当PAHs等污染物的排放大于生态环境的消除能力，环境中的污染物将会不断地积累，生态系统破坏而导致不可恢复。因此，在严控污染排放的同时，应时刻警惕生态系统的不可修复性恶化。

③对于高浓度PAHs污染土壤，应采取物理、化学、生物联合的修复方式，在高效、安全地去除污染物的同时，尽可能地降低修复成本，而且修复过程以尽可能地不破坏土壤的性质且生态安全为依据，保证土壤修复后的可利用性。在修复过程中，防止人为因素造成的PAHs及其降解中间产物在土壤环境中的渗漏及向大气环境中的扩散，研究并完善厌氧修复工艺，同时利用酶制剂、化学催化剂等加速PAHs的┙到狻＊

参考文献

［1］ 李新荣，赵同科，于艳新,等．北京地区人群对多环芳烃的暴露及健康风险评价［J］.农业环境科学学报，2009，28(8):1758-1764.

［2］ 曹云者，柳晓娟，谢云峰，等．我国主要地区表层土壤中多环芳烃组成及含量特征分析［J］.环境科学学报，2012，32(1):197-203.

［3］ ZHANG Y X,TAO S,SHEN H Z,et al.Inhalation exposure to ambient polycyclic aromatic hydrocarbons and lung cancer risk of Chinese population［J］.Proceedings of the National Academy of Sciences,2009,106(50):21063-21067.

［4］ SEO J S,KEUM Y S,LI Q X.Bacterial degradation of aromatic compounds［J］.International Journal of Environmental Research and Public Health,2009,6(1):278-309.

［5］ 毛健，骆永明，滕应,等．高分子量多环芳烃污染土壤的菌群修复研究［J］．土壤学报，2010，47(1):163-166.

［6］ 王新，李培军，巩宗强，等．混合固定化酵母菌对苯并芘污染土壤的修复［J］．环境污染与防治，2008，30(1):1-8.

［7］ PARALES R E,EMIG M D,LYNCH N A,et al.Substrate specificities of hybrid naphthalene and 2,4瞕initrotoluene dioxygenase enzyme systems［J］.Journal of Bacteriology,1998,180(9):2337-2344.

［8］ 魏明宝，魏丽芳，李军,等.细胞电融合构建高效蒽降解重组菌株的研究［J］．农业环境科学学报，2006，25(S):725-728.

［9］ RAHMAN K S M,RAHMAN T J,KOURKOUTAS Y,et al.Enhanced bioremediation of 玭瞐lkane in petroleum sludge using bacterial consortium amended with rhamnolipid and micronutrients［J］.Bioresource Technol,2003,90(2):159-168.〖ZK)〗

［10］ 刘魏魏，尹睿，林先贵,等.生物表面活性剂强化微生物修复多环芳烃污染土壤的初探［J］.土壤学报，2010，47(6):1118-1124.

［11］ 宋玉芳，孙铁珩，许华夏．表面活性剂TW80对土壤中多环芳烃生物降解的影响［J］．应用生态学报， 1999，10(2):230-232.

［12］ ARINO S,MARCHAL R,VANDECASTEELE J P.Identification and production of a rhamnolipidic biosurfactant by a Pseudomonas species［J］.Applied Microbiology and Biotechnology,1996,45(1):162-168.

［13］ DING K Q,LUO Y M,SUN T H,et al.Bioremediation of soil contaminated with petroleum using forced瞐eration composting［J］.Pedosphere,2002,12(2):145-150.

［14］ URURAHY A F P,MARINS M D M,VITALR L,et al.Effect of aeration on biodegradation of petroleum waste［J］.Rev.Microbiol,1998,29(4):254-258.

［15］ 丁洁，陈宝梁，朱利中．黄孢原毛平革菌菌球对多环芳烃的生物吸附和生物降解作用［J］．科学通报，2012，57(24):2276-2284.

［16］ KHAITAN S,KALAINESAN S,ERICKSON L E,et al.Remediation of sites contaminated by oil refinery operations［J］.Environmental Progress,2006,25(1):21-31.

［17］ KASTNER M,BREUER睯AMMALI M,MAHRO B.Impact of inoculation protocols,salinity and pH on the degradation of polycyclic aromatic hydrocarbons(PAHs) and survival of PAH瞕egrading bacteria introduced into soil［J］.App Environmental Microbiology,1998,64(1):359-362.

［18］ STAPLETON R D,SAVAGE D C,SAYLER G S,et al.Biodegradation of aromatic hydrocarbons in an extremely acidic environment［J］.Applied and Environmental Microbiology,1998,64(11):4180-4184.

［19］ LEE C H,LEE J Y,JANG W Y,et al.Evaluation of air injection and extraction test at a petroleum contaminated site［J］.Water,Air and Soil Pollution,2002,135(1):65-96.

［20］ JUHASZ A L,NAIDU R.Bioremediation of high molecular weigh polycyclic aromatic hydrocarbons:a review of the microbial degradation of benzo［a］pyrene［J］.International Biodeterioration & Biodegradation，2000,45(1/2):57-88.

［21］ KAEMPFER P,STEIOF M,BECKKER P M,et al.Characterization of chemoheterotrophic bacteria associated with the in瞫itu bioremediation of awaste瞣il contaminated site［J］.Microbial Ecology,1993,26(2):161-188.

［22］ PRITCHARD H P,COSTA C F.EPA′S Alaska oil spill bioremediation project［J］.Environmental Science and Technology,1991,25(3):372-379.

［23］ 王菲，苏振成，杨辉，等．土壤中多环芳烃的微生物降解及土壤细菌种群多样性［J］．应用生态学报，2009，20(12):3020-3026.

［24］ KUIPER I,LAGENDIJK E L,BLOEMBERG G V,et al.Rhizoremediation:a beneficial plant瞞icrobe interaction［J］.Molecular Plant睲icrobe Interactions,2004,17(1):6-14.

［25］ 张慧，党志，易筱筠,等．玉米修复芘污染土壤的初步研究［J］．环境化学，2010，29(1):29-34．

［26］ 李烜桢，林先贵，尹睿,等．产漆酶食用菌的粗酶液对多环芳烃降解研究［J］．环境工程学报，2010，4(12):2888-2892.

［27］ 张海荣，李培军，孙铁珩,等．四种石油污染土壤生物修复技术研究［J］．农业环境保护，2001，20(3):78-80.

［28］ ROBERT M,PETER S,HEINRICH S.Ex瞫itu process for treating PAHs contaminated soil with Phanerochaete Chrysosporium［J］.Environ Sci Technol,1997,31(9):2626-2633.

［29］ 毛丽华,刘菲,马振民,等.生物通风堆肥法修复原油污染土壤的实验研究［J］.环境科学学报,2009,29(6):1263-1272.

［30］ 徐向阳，冯孝善．五氯酚(PCP)污染土壤厌氧生物修复技术的初步研究［J］．应用生态学报,2001,12(3):439-442.

［31］ HAKSTEGE A L,VAN GELDERMALSEN L A.Pilot remediation of sediment from the petroleum harbour in Amsterdam［J］.Water Science and Technology,1998,37(6):403-409.

［32］ CHANG B V,SHIUNG L C,YUAN S Y.Anaerobic biodegradation of polycyclic aromatic hydrocarbon in soil［J］.Chemosphere,2002,48(7):717-724.