刺激植物响应蛋白基因獷pl1的载体构建及酵母转化

遇文婧 刘志华 王志英 古丽吉米拉米吉提 黄颖 刁桂萍

（1.东北林业大学林学院，黑龙江哈尔滨150040；2.黑龙江省森林保护研究所，黑龙江哈尔滨 150040）お

摘要 ［目的］构建刺激植物响应蛋白獷pl1基因的真核表达载体，筛选多拷贝酵母转化子。［方法］以深绿木霉（玊richoderma atroviride）ACCC30153的cDNA为模板进行PCR获得獷pl1基因片段，并将目的片段插入表达载体pPIC9K的相应位置，获得重组表达载体，并将pPIC9K勃獷pl1转入毕赤酵母（玃ichia pastoris）GS115中，并用不同中终浓度的遗传霉素G418筛选多拷贝重组酵母菌株。［结果］对重组载体进行PCR及双酶切检测为阳性；在含有终浓度为2 mg/ml遗传霉素G418的YPD平板上筛选得到7株多拷贝的转化子GS115睧pl1，经PCR鉴定1株转化子呈阳性。［结论］ 獷pl1基因的载体构建及多拷贝酵母转化子筛选为以后大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定基础。

关键词 深绿木霉ACCC30153；刺激植物响应蛋白；毕赤酵母

中图分类号 SB763.1文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06163-03

お

Vector Construction of the Eliciting Plant Response Protein Gene 獷pl1 and Yeast Transformation

YU Wen瞛ing, DIAO Gui瞤ing et al

(Heilongjiang Forestry Protection Institute, Harbin, Heilongjiang 150040)

Abstract ［Objective］ To construct eukaryon expression vector of the eliciting plant response protein gene 獷pl1 and screen multicopy yeast transformant. ［Method］ Based on the cDNA from biocontrol agent 玊. atroviride strain ACCC30153, the 獷pl1 gene segment was obtained by PCR and constructed into vector pPIC9K to obtain the recombinant vector pPIC9K勃獷pl1. The recombinant vector was transformed into 玃. pastoris strain GS115, and the multicopy yeast transformants was screened by Geneticin 418 with different final concentration. ［Result］ PCR and double digest detection identified that pPIC9K勃獷pl1 was obtained; the seven multicopy yeast transformants were obtained on the YPD medium containing with final concentration of 2 mg/ml, and one strain was positive by PCR detection. ［Conclusion］ The vector construction of Epl1 gene and screening of high expressing yeast transformant provide the high瞖fficiency expression strain for separating and purifying 獷pl1 and establish a basis for the further functional research of eliciting plant response protein Epl1.

Key words 玊richoderma atroviride ACCC30153; Eliciting plant response protein; 玃. pastoris

お

基金项目 哈尔滨市科技局青年科技创新人才项目（2013RFQXJ02）资助；中央高校基本科研业务费专项资金项目（2572014 BA08）。

作者简介 遇文婧（1984- ），女，黑龙江哈尔滨人，硕士研究生，研究方向：森林保护。*通讯作者，副教授，从事森林保护研究。

收稿日期 20140605

刺激植物响应蛋白Epl1（Eliciting plant response protein 1）是一种小分子分泌型半胱氨酸富含蛋白，属于cerato瞤latanin家族。对来源于绿色木霉（玊.virens）刺激植物响应蛋白SM1［1］和深绿木霉（玊.atroviride）的刺激植物响应蛋白Epl1研究表明，2个蛋白均对植物无任何毒性，还具有促进植物生长提高植物对病害的免疫作用［2］。王允等［3］将棘孢木霉（玊.asperellum）T4菌株的獷plt4（Epl1）基因转化到毕赤酵母（P.pastoris）中，用重组蛋白Eplt4处理大豆叶片，接种大豆灰斑病（Cercosporidium sofinum ）12 h后，感病区域（0.75%）明显低于未用EplT4处理的大豆叶片（5.17%）。Djonoviヽ＇等研究表明，深绿木霉（玊.atroviride）ATCC 74058 菌株的Epl1蛋白能在不同碳源诱导下检测到，而且在立枯丝核菌（玆hizoclonia solani）细胞壁诱导和立枯丝核菌对峙培养条件下均高表达［4］。Freitas等对来源于绿色木霉刺激植物响应蛋白SM1研究发现，用缺失SM1基因的木霉处理感染炭疽病的玉米叶片，叶片病斑明显多于野生型木霉处理过的感病叶片，证明SM1基因能够诱导植物产生系统抗性（ISR）［5］。上述研究都证实了刺激植物响应蛋白是木霉诱导抗性机制所需要的。笔者从深绿木霉ACCC30153菌株中分离出一个刺激植物响应蛋白獷pl1基因，将其ORF 的cDNA构建到高效毕赤酵母真核表达载体上，并用电转化方法将獷pl1基因转化到毕赤酵母GS115中，通过遗传霉素筛选获得转基因毕赤酵母菌株，以期为后续大量分离纯化Epl1蛋白并研究其功能奠定良好基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体。深绿木霉（玊.atroviride）ACCC30153菌株，由中国农业微生物保藏管理中心提供；毕赤酵母（玃.pastoris）GS115菌株、真核表达载体菌株TOP10F′瞤PIC9K和大肠杆菌TOP10 菌株，均由哈尔滨工业大学生物实验室提供。

1.1.2 主要试剂。内切酶獷coR I，玁ot I，玈ac I及T4 DNA连接酶，购自Promega公司；玊aq plus DNA Polymerase，购自上海生工公司；DNA Marker DL2000，购自北京泛基诺生物技术公司；酵母基因组DNA提取试剂盒，购自天为时代公司；Geneticinq（G418），购自Invitrogen公司；（NH4）2SO4，购自Amresco公司。

1.2 方法

1.2.1 深绿木霉獷pl1基因高效毕赤酵母真核表达载体构建。在深绿木霉Epl1的ORF序列两端引入獷coR I和玁ot I酶切位点，进行PCR扩增并回收目的片段。采用獷coR I和玁ot I双酶切，将目的片段连入pPIC9K 载体，获得pPIC9K勃獷pl1重组质粒，并对重组质粒进行PCR和双酶切检测。根据獷pl1基因序列和酵母表达载体的多克隆位点设计并合成的引物序列如下：

上游引物Ep1y：5睞TCGGAATTCGATACGGTCTCCT睞CGACAC3（划线部分为獷coR I酶切位点）；

下游引物Ep2y：5睠GATGCGGCCGCGAGGCCGCAGTTGCTCACGGC3（划线为玁ot I酶切位点）。

1.2.2 毕赤酵母转化及其转化子的筛选。采用电转法将重组质粒转化到感受态酵母细胞中，涂于RDB（186 g/L 1 mol/LB山梨醇，10 g/L琼脂粉，100 ml/L 10×Dextrose，100 ﹎l/L 10×酵母氮源碱，2 ml/L 500×Biotin，10 ml/L 100×50 含L补劝彼幔琇 蛋氨酸，L怖蛋彼幔琇擦涟彼岷蚅惨炝涟彼岬陌被酸）平板，30 ℃培养。挑取单菌落摇菌，然后分别取10 μl菌液点在含遗传霉素0、0.5、0.75、1.0、1.75和2.0 mg/ml YPD平板上培养，挑取含高浓度遗传霉素G418的YPD平板上的转化子，于BMGY培养基中30 ℃振荡培养，提取酵母基因组DNA，并进行PCR检测［6］。

2 结果与分析

2.1 刺激植物响应蛋白獷pl1基因真核表达载体的构┙ 对所构建的深绿木霉獷pl1基因真核表达载体进行了PCR和双酶切验证。用载体构建引物可从转化子中扩增出大小为400~500 bp左右的目的片段（图1），初步验证了目的基因已经于载体pPIC9K链接成功。用獷coR I和玁ot I进行双酶切同样可获得目的基因条带（图2），说明獷pl1基因已经正确连入载体pPIC9K中。

注：M为DNA marker DL2000；1-4为PCR产物。

图1 重组质粒pPIC9K睧pl1的PCR检测

注：M为DNA marker DL2000；1~3为重组载体pPIC9K睧pl1双酶切产物；4为空载体pPIC9K双酶切产物。

图2 重组质粒pPIC9K睧pl1双酶切检测

2.2 高效毕赤酵母转化子的筛选及鉴定 通过电转化将重组质粒转入毕赤酵母GS115感受态细胞，用不含组氨酸的RDB基本培养基对转化子进行筛选，以未转化酵母菌株GS115作为对照（图3）。

从RDB转化平板上选取50个重组子分别接种到含有不同终浓度遗传霉素G418的YPD培养基上，30 ℃培养5 d。图4表明，在不添加G418的YPD平板上所有转化子均继续生长；在含有终浓度为0、0.5、0.75和1.0 mg/ml G418 的YPD平板上少量转化子不生长；在含有终浓度为1.75 mg/ml G418的YPD平板上少量转化子生长；而在含有终浓度为2.0 mg/ml G418的YPD平板上仅有1株转化子生长。

PCR检测结果可从终浓度为2.0 mg/ml G418的YPD平板上的转化子中扩增出大小约为869 bp的目的片段（包含452 bp载体长度），与重组载体pPIC9K勃獷pl1的目的条带一致，呈阳性；而对照空载体转化子的PCR条带大小约为452 bp，与载体pPIC9K的PCR条带一致（图5）。以上结果表明，已成功获得1株高效表达的毕赤酵母转化菌株GS115睧pl1。

注：A为转入重组 pPIC9K睧pl1载体的毕赤酵母；B为未转化酵母菌株GS115。

图3 毕赤酵母转化

3 结论与讨论

刺激植物响应蛋白Epl1是来源于生物防治菌木霉（玊richoderma 玸pp.）的诱导植物系统防御响应的小分子疏水蛋白，能够刺激植物生长并提高其免疫能力。由于我们很难从木霉中直接分离大量天然的Epl1蛋白，因此Epl1重组蛋白的表达是研究的首选方向。

目前而言，一种是利用大肠杆菌原核表达载体进行重组表达。大肠杆菌表达的重组蛋白优势在于重组菌株构建容易，重组蛋白产量高，发酵条件即经济又可控制，唯一的缺点是重组蛋白往往形成包涵体，无活性，必须经过复性后才能后续应用。现已成功在大肠杆菌中表达的蛋白及酶类有：哈茨木霉（玊.harzianum）内切几丁质酶Chit33和Chit42［7］，以及深绿木霉（玊.atroviride）P1的内切几丁质酶ech30均在大肠杆菌中成功表达［8］。另外棘孢木霉（玊.asperellum）T203促进植物生长的1舶被环丙烷-羧酸脱氨酶ACCD在大肠杆菌pAlter睧X1中表达出有活性的酶［9］，此外还包括李氏木霉（玊.reesei）Rut C30的beta瞲ylanase等多种具有活性的酶类及蛋白类［10］。另一种是利用巴斯德毕赤酵母（玃.pastoris）高效表达系统进行酵母表达。毕赤酵母表达系统的优势在于可以在廉价的非选择性培养基中生长，具有旺盛的生长力，对发酵过程中产生的乙醇具有耐受性，有较好的发酵基础，非常有利于实现高密度发酵培养。现已经成功在毕赤酵母中表达的具有活性的酶及蛋白类有：绿色木霉（玊.virens）诱导子Sm1［11］及哈茨木霉（玊.harzianum）T34的角质酶Thcut1等［12］。

有关刺激植物响应蛋白的研究已有报道，但其分子作用

机制仍不十分清楚。试验将深绿木霉刺激植物响应蛋白

注：A为G418终浓度为0 mg/ml；B为G418终浓度为0.5 mg/ml；C为G418终浓度为0.75 mg/ml；D为G418终浓度为1.0 mg/ml；E为G418终浓度为1.75 mg/ml；F为G418终浓度为2.0 mg/ml。

图4 多拷贝酵母转化子的筛选

注：1为重组菌株GS115睧pl1基因组DNA的PCR产物；2为Marker DL2000；3为空载体转化子GS115瞤PIC9K基因组DNA的PCR产物；4为载体pPIC9K的PCR产物；5为重组质粒pPIC9K勃獷pl1的PCR产物对照。

图5 重组菌株GS115睧pl1的 PCR检测

獷pl1基

因克隆到分泌性表达载体pPIC9K上，可以使酵母转化子合成的重组Epl1蛋白直接分泌到培养基中，这种设计可大大简化后期重组Epl1的提取工艺，便于得到高活性Epl1产品。将阳性重组质粒pPIC9K勃獷pl1转化到毕赤酵母菌株GS115中获得多克隆拷贝的重组基因工程菌株GS115睧pl1，为獷pl1基因编码蛋白的大量生产、纯化、蛋白结构和功能研究提供了理论基础。

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