一株北高丛蓝莓内生真菌的液体发酵条件优化及生长动力学分析

李学龙 杨镇 王娜 龚娜 马晓颖 杨涛

(辽宁省农业科学院微生物工程中心，辽宁沈阳 110161）お

摘要

［目的］优化北高丛蓝莓内生真菌的液体发酵条件。［方法］以一株分离自北高丛蓝莓的内生真菌菌丝提取物为研究对象，对液体培养条件进行优化。选择一种适合工业化生产的培养基：玉米粉90 g/L，豆粕5 g/L，KH2PO4 1 g/L，MgSO4 0.6 g/L，维生素B1 10 ﹎g/L，以菌丝体得率为指标，通过正交试验考察培养温度、培养基pH、摇床转速、接种量，以确定最适培养条件。［结果］在培养温度25 ℃，摇床转速160 r/min，pH值7.0，接种量5%时，菌丝体生长量达到最大。［结论］初步得到该菌的生长动力学参数，为工业化生产提供一定依据。

关键词 发酵；内生真菌；培养条件；动力学分析

中图分类号 SB188文献标识码 A文章编号 0517-6611（2014）19-06157-02

お

The Growth Kinetics Analysis and Fermentation Conditions Optimization of a Strain of North High Plexus Endophytic Fungus from Blueberry

LI Xue瞝ong, YANG Tao et al

(Microbial Engineering Center, Liaoning Academy of Agricultural Sciences, Shenyang, Liaoning 110161)

Abstract ［Objective］ To optimize the liquid fermentation conditions of a strain of north high plexus endophytic fungus from blueberry. ［Method］ A medium suitable for industrial production was selected: corn flour 90 g/L, soybean meal 5 g/L, KH2PO4 1 g/L, MgSO4 0.6 ゞ/L, vitamin B1 10 mg/L. With mycelium yield as index, the culture medium temperature, pH, shaking speed, inoculum was investigated through orthogonal test in order to determine the optimum culture conditions. ［Result］ The results showed that the cultivation temperature 25 ℃, shaking speed 160 r/min, pH 7.0, inoculum 5%, mycelium growth reaches the maximum. ［Conclusion］ The microbial growth kinetics parameters were obtained, which will provide a basis for industrial production.

Key wordsFermentation; Endophytic fungi; Culture conditions; Dynamic analysis

お

基金项目 辽宁省自然科学基金项目（No.201102100）。

作者简介

李学龙（1984-），男，黑龙江牡丹江人，助理研究员，硕士，从事植物内生菌发酵工艺研究。*通讯作者，研究员，博士，从事农业微生物资源研究。

收稿日期 20140528

植物内生菌能产生促进植物生长物质，如植物生长素、赤霉素、细胞激动素等，能直接促进植物生长。从兰科药用植物中分离的5种内生真菌能产生赤霉素、吲哚乙酸、脱落酸、玉米素、玉米核苷等植物激素，对兰花的生长发育有较好的促进作用［1-2］。研究表明，内生菌可通过自身的代谢产物或借助于信号传导作用对植物体施加影响［3］。植物内生真菌的液体培养具有生产周期短、产量高、质量易于控制等优势，有利于规模化生产［4-6］。目前对北高丛蓝莓内生真菌的液体培养及代谢产物研究较少，笔者选择一种适合工业发酵的培养基，并通过液体培养条件的优化及生长动力学分析，以期为大规模工业化生产提供技术依据。

1 材料与方法

1.1材料

1.1.1

供试菌株。由辽宁省农业科学院微生物工程中心实验室从北高丛蓝莓根内分离，编号为LM003。

1.1.2

主要仪器。pH电极和溶氧电极，均购自梅特勒-托利多仪器有限公司；发酵罐，购自上海保兴生物设备工程有限公司；摇床，购自哈尔滨东联电子技术开发有限公司；培养箱，购自施都凯仪器设备（上海）有限公司。

1.1.3

主要试剂。所用试剂均为国产分析纯，市售。

1.2 方法

1.2.1

培养基的制备。①斜面及平板培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，琼脂18 g，蒸馏水1 000 ml，121 ℃灭菌25 min。②种子培养基。马铃薯200 g，葡萄糖20 g，麦芽粉5 g，维生素B1 0.5 mg，蒸馏水1 000 ml，121 ℃灭菌25 min。③发酵培养基。玉米粉90 g，豆粕5 g，KH2PO4 1.0 g，MgSO4 0.6 g，维生素B1 10 mg，蒸馏水1 000 ml，121 ℃灭菌25 min。

1.2.2

菌种活化。将编号LM003的菌种从试管斜面上接到平板培养基上，恒温25 ℃培养7 d。

1.2.3

一级种子培养。将活化好的真菌用打孔器琼脂挖块接种于装有200 ml种子培养基的三角瓶，于25 ℃，160 r/min摇床上振荡培养3 d作为种子。

1.2.4

液体发酵有关参数的考察。通过4因素3水平正交设计试验（表1）考察培养温度、培养基pH、摇床转速、接种量等条件对菌丝体生长的影响，筛选最佳发酵条件。

お

表1 培养条件正交试验设计

水平 A温度∥℃ B pH C转速∥r/min D接种量∥%

1 20 6 120 5

2 25 7 140 10

3 30 8 160 15

1.2.5

液体深层发酵的生长动力学考察。将确定的发酵培养基装于10 L发酵罐中，装量为6 L，121 ℃灭菌20 min，冷却后接种一级种子，接种量为5%，温度25 ℃，初始pH 7.0，搅拌转速160 r/min，培养7 d，每天取样。将收获的发酵液过滤，菌丝体用蒸馏水洗涤，80 ℃烘干3 h后测干重，发酵液直接用于pH和残糖的测定，制得生长代谢曲线。

2 结果与分析

2.1 一级种子液培养情况

摇床培养前2 d，接入的菌丝块呈球状不断增大，发酵液较澄清，第3~5天出现大量微小菌丝球，并不断增长，发酵液较粘稠，培养至第5天接入摇瓶进行培养参数的考察。

2.2 液体培养有关参数的确定

液体培养中，培养基初始体积的不同，对菌丝体干湿重之比影响较大，因此实验中采用菌丝体干重来衡量菌丝体生长情况，以g/L记。以下试验以液体发酵培养基进行发酵培养。

由表2可知，对菌丝体生长的影响因素由大到小的顺序是培养基pH值＞培养温度＞摇床转速＞接种量。菌体最适培养条件为A2B2C3D1该培养条件下，菌丝体干重为20.5 ゞ/L。对试验结果进行方差分析可知，pH值对液体菌种的培养有显著影响（玃<0.05）。pH值除了对菌体本身的影响外，还影响培养基中的有机化合物的离子化和营养物质的溶解度，从而影响菌体对基质的利用速度。

表2 液体培养条件的正交设计结果

因素 A B C D 菌丝体干重∥g/L

1 1 1 1 1 17.3

2 1 2 2 2 18.0

3 1 3 3 3 12.5

4 2 1 2 3 19.7

5 2 2 3 1 20.5

6 2 3 1 2 13.2

7 3 1 3 2 19.5

8 3 2 1 3 19.1

9 3 3 2 1 11.0

玐1 15.93 18.83 16.53 16.27

X2 17.80 19.20 16.23 16.90

X3 16.53 12.23 17.50 17.10

R 1.87 6.97 1.27 0.83

2.3 生长动力学考察结果

2.3.1

生长量变化曲线。 图1表明，菌丝体在0~1 d生长缓慢，为生长适应期，第2天起可见絮状菌丝逐渐增多。在第2~3天为对数生长期，菌丝体急剧增加，菌丝相互缠绕形成菌丝球。第4~5天为稳定生长期，体内次生代谢产物积累较多，第6~7天菌丝体生物量减少，发酵液变粘稠，开始自溶。因此确定菌丝体较适合的收获时间为第4~5天。

图1菌丝体液体深层培养时间对菌丝生长量的影响

2.3.2

糖代谢曲线。图2表明，菌丝体的生长过程在第1~3天对糖的利用比较迅速，最初糖浓度为19.0 g/L，培养7 d时剩余的还原糖浓度为9.7 g/L，生长过程中平均消耗速率为1.3 g/L·d，在对数生长期内还原糖吸收利用较快，浓度从17.1 g/L降到12.4 g/L，均消耗速率为2.35 g/L·d，第4~6天对糖的利用趋于缓慢。糖代谢曲线的趋势与菌丝体生长量的变化的趋势基本相符。

图2糖代谢曲线

2.3.3

pH值变化曲线。图3表明，菌丝体的液体培养过程中，pH值在7.0~5.15范围内波动，基本保持稳定。培养的第2~3天pH下降较快，第4~7天变化较小，第7天pH小幅上升，可能与菌丝体自溶有关。培养结束时发酵液pH值为5.19。

图3pH值变化曲线

2.3.4

溶氧DO变化曲线。图4表明，在菌体的生长过程中，溶氧值在21%~100%范围内波动。菌体发酵0~1 d的溶氧变化较小，经过24 h后，溶氧开始明显下降，菌体代谢旺盛，表现为对数生长阶段。发酵至4~6 d时，溶氧下降缓慢，菌体进入平衡生长期。发酵至6~7 d时发酵液溶氧值基本无变化，菌体生长基本保持停止状态，发酵结束。

图4 溶氧值变化曲线

3 结论与讨论

液体深层培养条件不仅影响菌丝体的生长速度和形态，而且对代谢产物的生成及后续提取也有很大影响，所以选择合适的培养条件对获得大量菌丝体和代谢产物具有重要

意义［7］。正交试验表明，菌丝体最适培养条件为培养温度

25 ℃，摇床转速160 r/min，接种量5%，培养基pH 7.0,该培养条件下，菌丝体干重为20.5 g/L。该培养基价格低廉，来源广泛，适合工业化生产使用。

生长动力学分析显示，菌丝体的生长基本呈“S”型曲线，第4~5天为稳定生长期，菌体内次生代谢产物积累较多，是收获菌体的最佳时间。大规模工业发酵是一个复杂的过程，发酵的逐级放大阶段不是培养体积的简单放大，需要调节温度、pH、溶解氧、细胞生长及产物形成等发酵参数，以提高发酵效率。因此要进一步研究上述发酵参数的变化情况，为大规模发酵培养提供技术支持。

参考文献

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