大肠杆菌抗氧化系统一oxyR调节子对细菌生长繁殖的调控作用

李欣 王利平 杜琳 杨丽鹏 乔家驹 李红玉 冯汉青

摘要：OxyR调节子是最早发现的细菌抗氧化防御系统之一，大肠杆菌oxyR调节子中参与抗氧化作用的基因成员包括katG、ahpC、ahpF等，通过对H2O2及过氧化物等的直接清除方式发挥作用。虽然该方面的研究很多，但对于大肠杆菌oxyR调节子对细菌生长繁殖的影响尚不清楚。通过对大肠杆菌oxyR、ahpCF、katE/G基因突变菌株进行研究，突变体JI370中ahpCF基因缺失导致其内源H2O2积累减少使其生长相应加快，而对于katG和katE基因突变体JI367和ahpCF、oxyR基因突变体LC74来说，胞内H2O2极显著上升会抑制细菌生长，并且H2O2积累量越大对其生长抑制作用越明显。与野生型菌株相比，ahpCF的缺失突变菌株JI370和ahpCF及oxyR双突变的LC74在菌株生长的潜伏期受到更显著的影响。结果表明：在CAT（catalase，CAT）与AHP（alkylhydroperoxide reductase，AHP）协同清除内源H2O2的作用中，AHP起到主导作用，并且在细菌的生长繁殖中，ahp基因起到重要的作用。

关键词：过氧化氢酶；过氧化氢；大肠杆菌；生长繁殖

中图分类号：Q935

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）04-0323-04

活性氧是生物体有氧代谢产生的一类具有较强氧化能力的含氧化合物，包括超氧阴离子、羟自由基等自由基物质和过氧化氢（H2O2）、单线态氧等非自由基物质。H2O2作为生物体信号的同时也会对生物体造成严重的伤害，因此生物体拮抗H2O2的机制研究一直是生物学研究的重点之—。

病原细菌对H2O2的降解（即抗氧化）是侵染中的重要毒性机制之一。经报道细菌抗氧化系统是细菌抵抗呼吸作用及环境因素导致的氧化损伤的一套防卫系统，oxyR调节子则是最早发现的具有抗氧化作用的系统之一。它是LysR家族的部分蛋白的转录激活子，存在氧化型和还原型两种状态，通过两种状态之间的转化，识别H2O2，能够调控过氧化氢酶（catalase，CAT）和烷基过氧化物还原酶（alkyl hydroperoxide reductase，AHP）的表达。大肠杆菌能产生两种过氧化氢酶（CAT）：HP I （katG基因产物）和HPⅡ（katE基因产物），两者在结构、动力学特性和调控机制方面存在显著差异。但任何一种基因的缺失都会导致自然突变率的增加和H2O2敏感性的上升，CAT主要是清除菌体内高浓度的H2O2。烷基过氧化物还原酶（AHP）由22kD的C催化亚基和56kD的F还原亚基组成，能够以NADPH或NADH作为协同因子参与被氧化的ahpC的再生，是大肠杆菌内源过氧化氢的最初清除剂，能够清除菌体内低浓度的H2O2，它能与具有高Km的CAT协同调控胞内H2O2浓度。

细菌中oxyR及其介导的抗氧化体系研究有一定进展。本实验室前期工作中发现细菌内源H2O2与细菌的繁殖密切相关，但是，oxyR介导的抗氧化体系在细菌生长繁殖中的作用还未见报道。作者以oxyR、ahp、kat基因突变株为研究对象，尝试探讨oxyR基因簇中各基因在细菌生长繁殖中的协同作用，为细菌抗氧化调控机制的研究提供科学证据。

1材料与方法

1.1材料

大肠杆菌野生型菌株MG1655、ahp基因C和F亚基的双突变菌株JI370（（ahpC-ahpF'） del kan：：'ahpF）、ahp基因C和F亚基以及oxyR基因共同缺失的突变菌株LC74 （delOxyR：spec （ahpC-ahpF'）del kan：：'ahpF），均由美国伊利诺斯州立大学的Imlay教授惠赠。将冻干保存的上述菌株取干粉划线接种到LB平板上，37℃下培养16h以上，挑单菌落至LB液体培养基中，37℃培养至菌液浑浊，甘油保存菌种，备用。

1.2主要试剂

荧光染料AR（amplex Red），辣根过氧化物酶（HRP）购自美国Sigma公司。过氧化氢酶（CAT）、过氧化氢、磷酸二氢钾、磷酸氢二钾购自上海生工公司，所用化学试剂均为分析纯。

1.3荧光法检测内源H2O2

培养大肠杆菌野生型和突变体菌株至对数期，离心收集菌体，用无菌水重悬15min，备用。1mg AR溶解于0.75mL DMSO中，避光保存。用50mmol/L磷酸钾缓冲液（pH=7.8）溶解HRP形成终浓度为0.02g/L酶液。测定H2O2时，用0.45mL的待测样品液与0.25mL AR和0.25mL HRP混合，采用F-4500荧光分光光度计检测其荧光强度，并用标准液做出标准曲线转换为H2O2浓度。采用激发波长525nm，发射波长550～650nm。

1.4CAT处理

菌株接种后在不同时间点加入初始浓度为15U/mL的CAT（文中所提CAT均为此浓度），摇匀，继续37℃振荡培养。

1.5生长曲线测定

420nm下，可见分光光度法进行光电比浊测定，检测时稀释菌悬液，将吸光值控制在0～0.4之间，按前期实验中建立的吸光值与菌细胞数对应关系（每0.1吸光值菌落数为3.65xl08/mL）计算菌细胞数。

1.6统计学分析

用SPSS 11.5进行统计学分析。独立样本间的差异显著性分析用Nonparametric Tests，包括Mann-Whitney Test、Moses Test、Two-Sample Kol-mogorov-Smirnov Test和Wald-Wolfowitz Test。T检验判定检验结果：P>0.05，不显著；P<0.05，显著；P

2结果

2.1基因突变和CAT处理引起H2O2变化

比较图1中对照组可以看出，3个不同基因突变体菌株中内源H2O2水平不同。与野生型菌株MG1655相比，ahp和oxyR功能同时缺失的突变体菌株LC74中H2O2水平有极显著升高（P

加入CAT后培养至16h，突变体JI370、JI367、LC74内源H2O2含量下降，但下降均不显著（P>0.05）。

2.2H2O2变化对大肠杆菌生长的影响

2.2.1不同突变体生长曲线

在细胞生长初期，野生型MG1655与突变体JI370生长曲线相近，但突变体JI367和LC74稳定期的菌细胞浓度远远低于MG1655和JI370，表现出明显的生长缓慢。对数生长期至稳定期，野生型与突变体JI370生长接近，但远高于突变体JI367和LC74。且突变体LC74出现明显的对数期延迟（图2）。

2.2.2CAT作用时间点不同对野生型菌株生长的影响

与对照组相比，4、7、10、13h加入CAT，在15h时测定菌株MG1655菌细胞数分别下降了22.22%、10.63%、7.97%、1.25%。即4h加入CAT对大肠杆菌的生长抑制率最大。因此，菌株培养至4h时为加入CAT的最佳作用时间点。

2.2.3CAT处理对突变体生长曲线的影响

在野生型及突变体菌株接种后培养4h时加入CAT，进一步明确CAT处理后不同基因突变体菌株的反应差异。由图3可知，CAT对MG1655、JI370、JI367、LC74生长抑制作用明显，并且对4种菌株的抑制程度不同。由对照和CAT处理后菌株生长的差值可清晰地看出，CAT对JI370的抑制作用最大，LC74次之，对数期（8～13h）抑制作用最为明显，第8h抑制作用最大，呈现逐步下降的趋势。CAT对MG1655的抑制程度最小，稳定期（21～37h）抑制作用明显，衰亡期的抑制作用降低。

3讨论

JI370是在野生型菌株中敲除ahpC和F基因的双突变体，本实验室的前期结果显示其细胞中AHP的缺失诱导了CAT的活性出现反馈性的显著提高，导致胞内H2O2的水平显著降低（图1）.Imlay教授的研究结果显示：ahpCF突变株总CAT含量比野生型菌株高7倍，与本实验结果一致。在黄单胞菌，铜绿假单胞菌中，研究者均发现ahp突变诱导CAT产生，多种细菌中均存在CAT和AHP合成之间的相互补偿作用，LC74是ahpC/F， oxyR的三突变体，oxyR基因的突变，导致细菌无法识别外源和内源的H2O2，不能启动H2O2降解机制，导致H2O2分子在体内发生积累（图1）。结果显示3个突变体H2O2积累量不同，生长情况亦不同（图2）。与野生型相比，突变株JI370没有明显的生长缺陷，并且在对数期更快速的生长，作者推测是细胞通过katG充分诱导CAT活性的上升，以补偿ahpCF引起的损失；突变体JI367胞内H2O2有所积累，推测其积累量影响菌株正常生长，所以生长速度明显下降；而突变体LC74胞内H2O2大量积累，当其积累到一定浓度时，开始抑制细胞的正常生长繁殖，这很可能是LC74生长缓慢的原因。综上可知：oxyR基因簇调控下的不同突变体在正常生长过程中，细菌内源H2O2积累量与生长抑制程度成负相关，暗示抗氧化体系相关基因表达的变化，不仅影响H2O2的水平，更影响菌株整体的生长与繁殖。

过氧化氢酶（CAT）处理的进一步的结果显示：CAT对kat基因缺失菌株JI367的影响与野生型菌株类似，整个生长期影响较小，其中对数期的菌液浓度下降最为明显。显示抗氧化基因对细菌维持正常的生长繁殖具有积极的作用。野生型菌株胞内正常的抗氧化系统基因表达，能够调控胞内维持较为稳定的氧化和抗氧化平衡。暗示kat对于内源H2O2的作用不大，在生长繁殖中的调控作用也不明显。与Imlay教授等提出CAT主要清除外源H2O2的结论相符。

与野生型菌株相比，ahpCF的缺失突变菌株JI370和ahpCF及oxyR双突变的LC74在菌株生长的潜伏期受到更显著的影响。说明在CAT与AHP的协同作用中，AHP起到主导作用，并且在细菌的生长繁殖中，ahp基因至关重要。

综上可知，在ahp、kat、oxyR基因协调H2O2积累作用中，ahp基因对内源H2O2的调控起主导作用，oxyR基因起诱导、补偿作用。因此，在大肠杆菌生长繁殖过程中，oxyR作为一个全局性的转录调控因子，介导和调控oxyR、kat和ahp基因，并通过其相互协同作用，识别调控H2O2，影响菌株整体的生长与繁殖。

本实验室前期结果证明，黄单胞菌中H2O2的产生与细胞分裂进程密切相关，并对细胞的生长起到积极作用。本实验的结果显示，oxyR基因簇突变和CAT处理都会引起菌体内H2O2水平变化，并影响其生长繁殖情况。在细胞中，H2O2的积累可能具有更为复杂的意义。本实验为进一步研究H2O2在胞内作用的细胞时期，深入研究细胞增殖中H2O2时空定位变化的机制提供了理论支持，也为深入研究oxyR基因簇的功能提供了新的思路。