铁吸收调节蛋白的研究现状

刘晓隽 王涛 邱冠周 杨宇

摘要：铁吸收调节蛋白（ferric uptake regulator，Fur）是多种微生物茵体内调控铁的一种蛋白质，它编码一个铁感应器以及转录调控因子，可以根据细胞内Fe2+的浓度，氧化应激以及毒性来调控铁载体合成相关基因的表达。研究发现Fur不仅调节与铁相关的物质代谢，也与其他的物质代谢有着紧密的联系。综合国内外研究进展介绍了Fur的结构与功能，阐述了Fur在生物冶金、农业、医药等方面的研究进展，并对其应用前景以及研究趋势进行了展望。

关键词：铁吸收调节蛋白；铁代谢；结构与功能；生物冶金；应用

中图分类号：Q513

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）04-0357-06

铁吸收调节蛋白（ferric uptake regulator，Fur）作为调节细菌中铁离子代谢的重要的蛋白质，是由Fur基因所编码的，是目前研究最为广泛和深入的与铁代谢的相关蛋白质。Fur最初是由Bagg等在大肠杆菌中首先发现的，在铁的代谢中扮演着重要的作用，在细菌体内扮演着维持铁稳态的核心作用，近年来随着技术的不断进步，人们从多个方面对其进行了研究，同时科研人员在其他细菌物种也发现了它的同源蛋白，由于铁是细菌生长的必需元素，因此Fur对于细菌具有重要的作用，研究发现Fur不仅参与了铁的代谢同时参与了细菌体内的多种物质代谢，由此引起了科学家的广泛关注Fur对于铁的具有调节作用，因此在利用铁氧化的生物冶金中具有重要作用，同时Fur与植物致病菌以及人体致病菌中的致病性有着关联性，目前Fur蛋白已经成为研究细菌中铁代谢领域的热点问题之一。

1Fur基因的结构与功能解析

1.1Fur基因的结构

Althaus等认为Fur最初是以一种不带活性的脱辅基蛋白状态存在的，当它与铁离子键合时活性被激活，这个状态是通过键合到一个称之为（Fur box）特殊的序列实现的。在铁离子存在的条件下Fur操纵子与它的启动子在称之为Fur box发生交互作用，Fur盒具有一个GATAATGATAAT-CATTATC共同序列，当添加二价铁离子的时候，Fur的表达受到了cAMP受体蛋白、氧化应激反应刺激这些因素调节。Tiss等基于分光光度法分析发现大肠杆菌的铁调节蛋白的55位酪氨酸，以及Fur box的18位以及19位共识胸腺嘧啶参与了键合。基于Fur与DNA的复合物所提出的构象模型：每个DNA都连接到H4（A52-A64）铁调节蛋白螺旋。同时认为这种内在反应是类似Fur以及它们各自的DNA box所共有的特征，例如锌调节吸收蛋白，镍吸收调节蛋白。

Mark等研究大肠杆菌的Fur时，通过定点突变分别对Fur基因的亮氨酸以及丝氨酸，以及大肠杆菌铁吸收调节蛋白阻遏因子的12个组氨酸以及4个半胱氨酸进行突变。通过研究突变对其体内以及体外造成的影响，发现92位点以及95位点的半胱氨酸残基对于Fur的活性具有重要的作用。然而Wang等对迟钝爱德华氏菌（Ed-wardsiel latarda）的Fur进行定点突变，分析表明C92s以及C95s能够使大肠杆菌的Fur失活，然而92位点以及95位点的半胱氨酸残基的突变对于迟钝爱德华氏菌Fur突变体E112K的Fur表达没有影响。

Stojiljkovic等研究大肠杆菌Fur抑制因子的氮端以及碳端结构域来在启动子识别以及二聚化的功能。研究Fur包含氮端以及碳端结构域融合蛋白具有抑制以及二聚化铁调节蛋白调节lac -Z融合基因的能力。当抑制因子CI857的碳末端熔融，氮末端结构域阻遏铁调节蛋白调节因子lac-Z融合。这两种融合蛋白当铁含量丰富或者铁含量缺少时都能激活，由此认为Fur的氮末端参与到Fur响应启动子的识别，而碳末端参与的是阻遏寡聚化。

1.2Fur的功能解析

Fur的主要生理功能是当铁离子充足时抑制铁吸收，从而维持细菌内的铁平衡。在最新的研究中发现Fur是作为一个核心调控着铁的吸收功能（当铁处于缺乏状态）以及铁储存酶的表达以及铁利用酶的表达（当铁的含量充足的情况下）。

Jose等利用SELEX技术研究从固定相分离得到的DNA键合蛋白家族，结果发现其在保护微生物防止氧化以及营养压力中扮演重要的角色，在硅片中分析启动子区域alr3808，一个从蓝藻（Yanobacteria） sp. PCC7120分离的dps同源表明：铁离子盒子与那些为人所熟知的铁调节蛋白A具有高度的同源性，证据表明通过Fur A调节dpsA主要涉及体内和体外两条途径。EMSA分析表明dpsA启动子区域的Fur具有高度的亲和性，dpsA的表达分析通过插入一个alr1690突变（它会阻遏Fur A的表达增加）结果显示dps A的合成减少。这些研究表明Fur A在dps A的调控中扮演着一个重要的角色。

铜绿假单胞菌（P.Aeruginosa）是假单胞菌中最常见的院内感染条件致病菌，许多物种具有产生黄绿色铁离子载体的特征，同时具有产生铁的亲和力较低第二种铁载体。因此，它们能够通过不同的依赖TonB受体接受外源性异种铁载体。铁离子的吸收主要是通过中央调控因子Fur及细胞质外的西格玛（sigma）因子或者其他种类的调控因子共同构成一个组件系统。铜绿假单胞菌的Fur调节子（实验证明和/或预测）已经被揭示，通过分析Fur调控因子基因揭示了铁以及硫的调节子的重叠也发生在群体感应系统的特征。

尽管通常认为铁调节蛋白是一个依赖于金属的阻遏因子，但是Jin等也发现了其他直接或者间接的机制能够激活其表达，现在我们知道关于Fur的金属的选择性以及生物功能存在一个巨大的家族包括铁传感器铁锌锰镍调节蛋白。尽管大量的实验表明关于Fur的金属感应机制存在争议，但是，其他家庭成员使用金属催化氧化反应来检测过氧化应力（peroxide-stress）或血红素（heme）具有有效性。

氢化酶（hydrogenase）全称为氢气-受体氧化还原酶，由Adams首先报道，能够可逆地催化氢气氧气与所生成的金属蛋白质。Constanze通过对大肠杆菌进行研究，发现Fur以及铁代谢对镍铁氢化酶的表达具有重要作用。他们发现在Fur的缺失突变体中氢化酶的活性近似下降了80%～90%，以多种转运系统中的Fur缺失突变体中氢化酶的减少作为证据，表明不仅铁的供应对于镍铁氢化酶的合成极为重要，同时细胞内铁的代谢也与氢化酶的协调通常也对氢代谢有重要作用，而这协调的关键在于Fur。导致铜绿假单胞菌产生有毒性超氧化物还原，有几个重要的酶包括铁和锰辅酶的超氧化物歧化酶（superoxide dismu-tase，SOD）和过氧化氢酶。目前在铜绿假单胞菌种调节这些酶的机制尚不清楚，Hassett等为了解决这些问题用了两种突变体A4以及C6，在突变体中发现Mn—SOD增加和过氧化氢酶的活性减少，通过给野生型添加铁螯合剂会导致Mn-SOD活性的增加和总的过氧化氢酶活性减少，与Fur突变体的表型性状类似。在所有的突变体都检测到含铁的绿脓杆菌螯铁蛋白以及含铁带荧光的水溶性荧光素，而它们介导着铁出现上调。结果表明铜绿假单胞菌在Fur位点的突变影响有氧增长和SOD和过氧化氢酶的活性，推测降低铁载体介导的铁的吸收，特别是带荧光的水溶性荧光素，可能是造成这种影响的一个可能的机制。

2Fur在异氧微生物中的研究进展

十字花科黑腐病菌又称甘蓝黑腐病菌或野油菜黄单胞菌野油菜致病变种，病原学名为Xan-thomonas campestris pv.campestris（简称Xcc）。铁对于该病原体具有重要的作用，Jittawuttipoka等 分离了一株Fur发生自发突变的Xcc，菌株，发现该菌株的铁转运基因出现了增加以及高水平的铁载体导致细胞内的铁离子含量很高，导致这些突变体的抗氧化性降低。通过对突变菌株的研究表明：铁载体以及铁上调机制的表达的增加会导致细胞内铁离子的增加。由此，突变体在加富培养基中表现出有氧生长缺陷，对氧压的抗性减弱，以及对易感植株的毒性减弱。此外在一株Fur突变Xcc菌株中发现其对寄主植株的的侵染能力降低。因此推测Fur在Xcc菌株中扮演着一个重要角色。通过研究Fur在十字花科黑腐病菌中所起的作用，为预防植物十字花科黑腐病提供了新的方向。

植物病原丁香假单胞菌（Pseudomonas sy-romgae）作为一类重要的荧光假单胞菌，能够在多种培养基上产生黄绿色荧光色素，该荧光色素是一种噬铁素（铁载体），对铁离子有高度亲和性，能结合环境中极其微量的游离铁离子，它的存在有助于增强荧光假单胞菌对铁素营养元素的竞争能力。在大多数的细菌中铁调节蛋白在操纵子扮演着一个至关重要的调控因子，不仅是因为它参与铁稳态，同时它也在多种细胞进程中发挥着作用。为了研究铁吸收调节蛋白在植物病原体丁香假单胞菌的作用，Cha等通过从一株菌株分离得到Fur的同系物，表型分析表明：铁调节蛋白缺失体BL33构成产生铁载体，表现出抑制群集运动的减少同时毒素和N-酰基高丝氨酸内酯也减少，与薄层色谱的结果一致。通过基因的实时定量PCR表明：psyI、psyR、QS这些基因的转录水平上调。Fur的突变体对植物病原体毒性的结果表明：铁调节参与植物与植物病原物相互作用。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）又称绿脓杆菌。最近Ochsner等研究铜绿假单胞菌外毒素与Fur之间的联系发现：通过T7表达系统在铜绿假单胞菌的过表达得到铜绿假单胞菌的铁调节蛋白克隆基因。Fur铁离子调节因子的启动子活性与两种铁载体相关：pyochelin与Py-overdin，研究外毒素A的表达发现pchR的启动子由对于pyoverdin合成起正调控的转录激活因子编码。pvdS由对于pyoverdin产生起正向调控的基因编码，它们都通过Fur进行特异性的识别。表明Fur抑制pchR与pvdS的表达是在一个铁含量高的环境中。然而无论是启动子区域外毒素A的编码或者启动子的操纵子regAB对于外毒素A的产生都是必不可少的，而这都与高浓度的Fur相关，这些数据表明铁调控外毒素A的毒性主要是通过其他的在Fur的控制之下因子控制的。

迟钝爱德华氏菌是一种对水产养殖中造成严重危害的病原菌。Hoshina首次报道其与日本鳗鲡红病有关。Suprapto等研究发现：非毒性的菌株与毒性的菌株所产生获取铁离子能力不相同，毒性菌株产生获取铁离子的能力要高于非毒性菌株。于是Kokubo等对铁载体进行研究，他们发现毒性菌株与非毒性菌株所产生的铁载体含量相同。Wang等从一条病鱼分离得到的迟钝爱德华氏菌株，克隆了编码迟钝爱德华氏菌的铁调控因子基因。迟钝爱德华氏菌的Fur能够与大肠杆菌的Fur发生互补，它能够使大肠杆菌的Fur缺失恢复活性。突变分析表明C92s以及C95s能够使大肠杆菌的Fur失活，然而迟钝爱德华氏菌Fur突变体E112K的Fur表达没有发生改变。迟钝爱德华氏菌负调控其Fur的表达，中断这个调控损伤细菌的生长，导致削弱细菌增长，以及改变了某些外膜蛋白的表达含量，以及减弱细菌的毒性。

鼠伤寒沙门氏菌（Salmonella typhimurium）是一种肠道致病菌。最近发现Fur对于Salnonela鼠伤寒沙门氏菌的耐酸性也有重要的作用，因为很少有人知道Fur对于肠道病原体生理机能的影响。Foster等通过系统的双向聚丙烯酰胺电泳分析哪些蛋白质与铁的水平相关，通过Fur突变体来确定哪些受到Fur的控制。36种蛋白质明显的是受到铁离子可用性的影响。尽管大多数受到负调控，但是有15种受到正调控，其中9种正调控蛋白质需要通过铁调节蛋白以及铁离子共同作用来实现表达，而有6种Fur在缺铁的条件下也会诱导。令人惊奇的是不是所有的铁调控因子受到Fur的影响，同时依赖Fur也不完全受到铁离子的多少的影响。因为Fur的突变体不能有效地进行酸的耐受性实验，我们通过比对双向电泳的的100种关于铁与酸的基因，发现绝大多数只受到一种压力的调节，只有7种其受到了铁离子的影响也受到了酸的影响，同时也受到Fur的控制，这些蛋白质也是耐酸性的调控蛋白，而这些调控蛋白合成一直受到铁调节蛋白的影响，而Fur的突变体缺乏诱导与耐酸性反应的稳定系统。结果提供了进一步的证据表明Fur具有广泛的影响基因表达以及细胞的生理通过铁调节蛋白突变体得到的。霍乱弧菌V.cholera是烈性肠道传染病霍乱的病原体，Sun等报导了编码霍乱弧菌Fur，它是从感染霍乱病毒病毒鱼中分离克隆，与大肠杆菌Fur有77%的相似，能与大肠杆菌Fur缺失突变互补，像大肠杆菌Fur、Furvh拥有两个半胱氨酸残基在92位以及95位，然而与大肠杆菌Fur不同，这些半胱氨酸构成金属离子配位的一部分，因此对于阻遏活性有重要作用。而92位以及95位的半胱氨酸被证明对于功能是无关紧要的。进一步的研究发现霍乱弧菌有一个信号序列，而这个序列存在于10个霍乱弧菌Fur中，而在非霍乱弧菌Fur不存在。系统的缺失分析表明霍乱弧菌铁调节蛋白碳末端12位残基是无关紧要的功能位点，这些结果表明，其激活机制或者是其确定的一些方面，霍乱弧菌的Fur与大肠杆菌的Fur可能是不同的。也非常有可能碳末端12位残基也能扮演任何激活机制以及霍乱弧菌Fur稳定性，以及提供局部结构蛋白质洞察功能，涉及到C137以及K138。

3Fur在自养微生物中的研究进展

嗜酸氧化亚铁硫杆菌（Acidithiobacillus fer-roxidans）A.ferrooxidans是一种在生物冶金中用来还原硫化矿中低品位的微生物。嗜酸氧化亚铁硫杆菌在无氧的条件下，主要是依靠Fe3+或者以S来接受电子、以H2提供电子，或者以Fe3+接受电子、以含有还原性的硫化物来提供电子来提供其生长所需的能量。而在有氧的条件下主要是依靠各种还原性的硫化物、H2，以及Fe2+的氧化来提供其生长所需的能量。Quatrini等在ATCC23270的基因组中发现一个可能是A.ferrooxidans的Fur的序列（以下简称FurA.f）。FurA.f与大肠杆菌的Fur具有高度的相似性，包括功能的保守序列，同时FurA.f与大肠杆菌的Fur的抗血清能产生交叉反应，在一个铁相应反应FurA.f能够与大肠杆菌的Fur缺失突变进行互补。通过凝胶阻滞（electrophoreticmobility shift assays， EMSA）实验发现FurA.f不仅能够与大肠杆菌的Fur的Fur-box进行特异性的结合，同时也能与A.f中的疑似Furbox结合。当大肠杆菌的启动子fiu与fhuF处在一个高的蛋白表达水平，FurA.f的表达受到抑制。而当fiu与fhuF启动子处在低浓度时，它的表达量将会提高，可能还有其他的Fur调控启动子卷入到铁氧化应激反应。

Ferraz等报导通过研究当嗜酸氧化亚铁硫杆菌以黄铜矿或斑铜矿作为唯一的能源时，研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌铁吸收系统的相关基因表达。实时定量PCR分析显示在斑铜矿存在的条件下对于与三价铁铁载体相关的7个基因表达没有影响，而黄铜矿的存在对与三价铁铁载体相关的7个基因表达出现了上调。生物信息学分析这些基因区域，揭示了三价铁转运调控因子存在3个假定DNA键合序列。电泳迁移率实验表明A.f菌带有组氨酸标记的纯化Fur蛋白在体外能够与这些假定的Fur boxes键合，在黄铜矿存在的条件下同时调查了两种Fur调控基因mntH以及dsrK的表达。然而Fur以及mntH的表达量上调，dsrK表达下调。当A.f菌株在含有黄铜矿培养基培养时，可能培养基中的低含量二价铁与Fur以及三价铁载体调控系统基因上调相关。通过建立A.f菌的同源模型揭示假定DNA键合蛋白表面存在正电残基，支持了之前猜测的DNA相互作用的模式。Fur以及三价铁离子载体的基因上调以及dsrK的下调表明在黄铜矿的存在下，由此可见Fur扮演着转录诱导剂以及阻遏剂的角色。

4展望

在生物冶金中应用最为广泛的嗜酸氧化亚铁硫杆菌，其Fur缺失突变的菌株仍旧未被发现，由此推测Fur基因对于该菌株是不可缺失的基因。尽管大肠杆菌的Fur基因已经被人工克隆，但是嗜酸氧化亚铁硫杆菌的Fur基因克隆未见报导。考虑到嗜酸氧化亚铁硫杆菌与大肠杆菌的Fur蛋白是同源蛋白，希望通过实现嗜酸氧化亚铁硫杆菌Fur蛋白的克隆，将其转化到大肠杆菌中，通过构建工程菌进一步地研究嗜酸氧化亚铁硫杆菌Fur蛋白的作用，从而为解决在生物冶金中Fe3+对细菌的毒害作用提供理论依据。

铁作为一种重要的元素，对于植物致病菌或者人体致病菌都是必不可少的，而Fur在细菌的铁调节中扮演着重要的作用，在研究过程中发现Fur对植物致病菌或者人体致病菌的毒性具有较大的影响，因此研究Fur对研发新的抑菌剂具有重要的作用。