鼠源抗人乳腺癌MRPl/ABCC1噬菌体Fab抗体库的构建

张学梅 赵彩红 李俊 罗晓 蒋葵

摘要：鼠源抗人乳腺癌多药耐药相关蛋白1（multidrug resistance-associated protein l，MRPl/ABCCl）噬菌体Fab抗体库的构建首先是利用乳腺癌组织匀浆液作为免疫原免疫BALB/e小鼠，成功免疫后提取小鼠脾组织的总RNA逆转录为cDNA。然后设计小鼠IgG各亚型的特异性Fab引物，PCR扩增Fd和L基因并依次连接到噬菌体载体pComb3中。重组体pComb3-Fab转化至E.coli XLl-Blue菌中，最后经辅助噬菌体VCSM13超感染.成功构建噬菌体Fab抗体库。以化学合成的MRPl/ABCC1膜表位10肽为抗原进行3轮淘选、富集，对淘选后获得的各级噬菌体抗体库进行ELISA检测和鉴定。成功获得的抗MRPl/ABCCl-10肽三级噬菌体Fab抗体库将为抗人乳腺癌MRPl/ABCCl Fab抗体的制备提供保障。

关键词：Fab抗体；多药耐药相关蛋白1 （MRPl/ABCCl）；乳腺癌

中图分类号：R392.12

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）04-0338-06

乳腺癌是世界范围内危害女性健康的恶性肿瘤之一。国内妇女乳腺癌的发病率比世界其他国家低，但最近的调查显示，其正呈逐年上升的趋势。化学疗法作为治疗肿瘤的经典方法之一，临床上被广泛应用于乳腺癌的治疗。然而，多药耐药的发生往往导致临床上绝大多数乳腺癌患者化疗失败。MRPl/ABCCl （multidrug resistance-as-sociated protein l，MRPl/ABCCl）是一种被认为和乳腺癌患者多药耐药发生密切相关的跨膜转运蛋白。Taheri等研究发现，相对于正常的乳腺组织，MRPl/ABCC1在乳腺癌肿瘤组织中的含量明显增高。Rudas等研究发现，乳腺癌患者接受化疗后肿瘤组织MRPl/ABCC1的含量明显高于化疗前肿瘤组织MRPI/ABCC1的含量。另外，韩晔等在研究MRPl/ABCC1在复发转移乳腺癌组织中的表达与乳腺癌的侵袭、复发及转移的关系时发现。MRPl/ABCCl在复发转移的乳腺癌组织中高表达，且与淋巴结转移明显相关。可见，加强对MRPl/ABCC1的检测，对乳腺癌多药耐药的监测至关重要。目前用于检测MRPl/ABCC1的特异性抗体几乎均为完整的单克隆抗体。完整的单克隆抗体相对分子质量大、组织穿透力弱，在MRPl/ABCCl的检测中具有局限性。本研究通过构建鼠源抗人乳腺癌MRPl/ABCC1噬菌体展示Fab抗体库，为进一步制备抗MRPl/ABCC1的小分子抗体（Fab抗体）提供实验基础。

1材料与方法

1.1材料

1.1.1试剂

TRlzol Reagent购自上海生工生物工程技术有限公司；逆转录试剂盒、PCR试剂盒、质粒提取试剂盒、DNA凝胶回收试剂盒、T4 DNA连接酶试剂盒、氨苄青霉素（Amp）、四环素（Tet）、卡那霉素（Kan）购自北京经科宏达生物技术有限公司；X-Gal、IPTG、Spe I、Xho I、Sac I和 Xba I购自宝生物工程（大连）有限公司；LB培养基购自美国BD公州；PEG8000购自美国Amresco公司；MRPl/ABCCl-10肽（DPIVNGTQEH）由上海强耀生物科技有限公司合成。ALP标记马抗小鼠IgG抗体购自美国Vector Laboratories公司；抗噬菌体蛋白Ⅲ抗体购自美国Abcam公司。

1.1.2动物

BALB/c小鼠购自大连医科大学动物中心。

1.1.3载体、宿主菌与辅助噬菌体

E.coli XLl-Blue菌种、E.coli Topl0菌种，噬菌粒载体pComb3均由大连大学医学研究中心分子药理实验室保存。T载体购自宝生物工程（大连）有限公司。辅助噬菌体VCSM13购自美国Agilent公司。

1.2方法

1.2.1动物免疫

将15例耐药大肠癌病理组织等量混合，加入适量灭菌生理盐水，用细胞匀浆仪制备成匀浆液（50g/L）。匀浆液与等体积弗氏不完全佐剂充分乳化后，用0.22μm微孔滤器过滤除菌即得到抗原液。抗原液经腹腔注射（0.5mL/10g）8只BALB/c小鼠。分别在初次免疫后14h和30h同样方法再次免疫BALB/C小鼠。7h后取小鼠血清。ELISA法测定抗体滴度。处死抗体滴度大于1：512的小鼠，留取脾脏组织。

1.2.2引物的设计与合成

从IMGT网站检索小鼠IgG各亚型（IgG1、IgG2a、IgG2b、IgG2c、IgG3）重链基因序列及轻链基因序列（K链和λ链）。利用Multalin在线比对软件分析重链FR1区及铰链区基因序列，设计重链Fd引物：5条上游引物：HBl：GCGCTCGAGCAGKTCCAGCTGAAGCAGTC；HB2：GCCCTCGAGCAGGTTCARCTGCARCAGTC；HB3：GCGCTCGAGCAGGTGCAGCTGAAGSAGTC；HB4：GCGCTCGAGGAAGTGMWGCTGGTGGAGTC；HB5：GCGCTCGAGGAAGTGAARMTTGAGGAGTC；和1条下游引物：HF1：GCGACTAGTGCATTTGCATGGAGGACAG；同时利用该软件分析轻链FR1区及恒定区基因序列，设计轻链L引物：5条上游引物：LBl：GCGGAGCTCGATRTTGTGATGACCCARAC；LB2：GCGGAGCTCGATGTTGTKSTGACYCAAAC；LB3：GCGGAGCTCGAAAWTGTKCTCACCCAGTC；LB4：GCGGAGCTCGATATCCAGATGACACAGAC；LB5：GCGGAGCTCCAGGCTGTTGTGACTCAGGA-ATC；和2条下游引物：LFl：GCGTCTAGACTCATTCCTGTTGAAGCTCT；LF2：GCGTCTAGAGGACAAACTCTTCTCCACAG）。其中Y=C，T； W=A，T； M=A，C；R=A，G；K=G，T；S=G，C。引物由南京金斯瑞生物科技公司合成。

1.2.3组织总RNA的提取和cDNA的获得

分别取100mg不同小鼠脾脏组织于研钵中，迅速加入液氮，研成粉末。加入TRIzol Reagent提取总RNA。紫外分光光度仪定量，琼脂糖凝胶电泳检测其完整性。然后按逆转录试剂盒说明获得cDNA。

1.2.4PCR扩增重链Fd段基因及轻链L基因

反应条件为：95℃预变性3min， 95℃变性30s，95℃退火30s，72℃延伸1min，共30个循环后72℃延伸10min。PCR产物经琼脂糖凝胶电泳鉴定后，按DNA凝胶回收试剂盒说明回收。

1.2.5轻链L基因与pComb3载体重组

轻链L基因经Xba I和Sac I双酶切，酶切产物进行凝胶回收并定量。T载体和回收后的轻链L基因，经T4 DNA连接酶连接，将连接产物热激转化至E.coli Topl0感受态细胞，并涂布LB/Amp/X-Gal/IPTG平板，37℃过夜培养。统计蓝、白斑数，并计算重组率。重组率=（白色菌落数/（蓝色菌落数+白色菌落数）×100%）。反复几次上述步骤，最终使白斑数达到1.0xl05以上，即得T-L库。提取T-L库质粒。分别将pComb3载体和T-L库质粒经Xba I和Sac I双酶切，酶切产物进行凝胶回收并定量。回收后的pComb3载体和回收后的轻链L基因，经T4 DNA连接酶连接，将连接产物热激转化至E.coli Topl0感受态细胞，并涂布LB/Amp/Tet平板，37℃过夜培养，计算总菌落数。用LB液体培养基刮取平板上菌落，加入终浓度至10%的甘油，-80℃保存。反复几次上述步骤，最终使pComb3-L克隆数达到1.Ox105以上，即得pComb3-L库。提取pComb3-L库质粒。

1.2.6重链Fd基因与pComb3-L载体重组

分别将pComb3-1库质粒和重链Fd基因经Xho I和Spe I双酶切，酶切产物进行凝胶回收并定量。回收后的pComb3-L质粒和回收后的重链Fd基因，经DNA连接酶连接，将连接产物热激转化至E.coli XLl-blue感受态细胞，并涂布LB/Amp/Tet平板，37℃过夜培养，计算总菌落数。用LB液体培养基刮取平板上菌落，加入终浓度至10%的甘油，-80℃保存。反复几次上述步骤，最终使pComb3-L-Fd克隆数达到1.0×l05以上，即得Fab抗体库。随机挑取10个单克隆，并提取质粒。各质粒分别经Xho I/Spe I、Xba I/Sac I双酶切，酶切产物进行凝胶电泳，计算Fab抗体库Fab基因插入率。

1.2.7抗人乳腺癌噬菌体Fab抗体库的扩增

取5mL抗人乳腺癌Fab抗体库接种于50mL LB/Amp/Tet液体培养基中，37℃、220r/min振荡培养4h （OD600nm≈0.4）。然后加入40μL滴度为1.19xl014pfu/μL的辅助噬菌体VCSM13，37℃、110r/min培养1.5h。加入50μL卡那霉素（80g/L），37℃、280r/min过夜培养。过夜培养菌液转入50mL无菌离心管，4℃、8000r/min离心30min。上清液转入新的离心管中，然后添加2gPEG8000和1.5gNaCl，混匀至溶质充分溶解，冰水中放置1.5h。4℃、8000r/min离心30min，弃上清，用2mL含l% BSA的TBS溶解沉淀。4℃、8000r/min离心5min，收集上清液，即扩增后的噬菌体Fab抗体库。取10μL噬菌体抗体库做不同梯度（10-1～l0-12）稀释，各稀释度噬菌体与XLl-Blue菌液（OD600nm≈0.4）按1：10混匀，37℃水浴30min。分别取10μL各梯度混合液涂布LB/Amp/Tet固体培养基，37℃过夜孵育。次日，统计菌落数，计算扩增后的噬菌体抗体库滴度。

1.2.8抗人乳腺癌MRPl/ABCCl Fab抗体库的淘选和富集

用MRPl/ABCCl-10肽（每孔25μg）包被ELISA板孔，4℃过夜；3% BSA满孔封闭，4℃过夜；每孔加入噬菌体Fab抗体库80μL，37℃孵育2h。TBST（每孔 350μL）清洗ELISA板孔1次（第2轮为5次、第3轮为15次），拍干。每孔加入80μL洗脱液，10min内反复吹打3次，立即加入10μL中和液，混匀。将混合液立即加到2mL的XLl-Blue菌液（OD600nm≈0.4）中，37℃水浴30min。取10μL菌液做不同梯度稀释并涂布LB/Amp/Tet固体培养基，37℃过夜孵育。次日，统计培养基上的菌落数并计算每轮淘选后噬菌体的滴度。剩余菌液加入到50mL无菌的LB/Amp/Tet液体培养基中，按1.2.7中步骤扩增并收集过夜培养液中的噬菌体，即抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-10肽一级库。取10μL噬菌体抗体库做不同梯度稀释并与E.coli XLl-Blue菌液（OD600nm≈0.4）按1：10混匀，37℃水浴30min。将各梯度混合液涂布LB/Amp/Tet固体培养基，37℃过夜孵育。统计总菌落数，计算每轮经淘选扩增后的噬菌体滴度。然后，将抗人乳腺癌MRPl/ABCCl一级库进行第2轮到第3轮淘选，计算每一轮淘选产出率。

1.2.9抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-1O肽Fab各级库的ELISA鉴定

取用MRPl/ABCCI-1O肽（25μg/孔）包被的ELISA板孔，各孔分别加入80λL空白对照（TB-ST）、阴性对照（VCSM13）、各级抗MRPl/ABCCl-10肽Fab抗体库，37℃孵育3h。均设3个复孔。用TBST清洗ELISA板孔15次，拍干。然后加入1：3000稀释的ALP标记的马抗小鼠IgG抗体，37℃孵育3h。TBST清洗ELISA板15次，拍干。每孔加入l00μL PNPP显色液，避光显色30min后加入10μL H2SO4（2mol/L）终止反应，BIORADModel 550酶标仪读值A405nm。

2结果

2.1组织总RNA的提取

经紫外分光光度仪测定，总RNA的浓度为9.64g/L，A260nm/A280nm=2.03。完整性良好（图1）。

2.2重链Fd和轻链L基因的扩增

以鼠源cDNA为模板，扩增重链Fd和轻链L基因。PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳并成像，在重链Fd基因PCR扩增产物电泳图中，650bp左右处可见基因片段（图2）；在轻链L基因PCR扩增产物电泳图中，650bp左右处可见基因片段（图3）

2.3Fab抗体库的构建

轻链L基因与T载体重组，平板上可见大量白色菌落和少量蓝色菌落，所有平板重组率均大于95%。白色菌落总数为1.03x105cfu。轻链L基因与pComb3载体重组，pComb3-L库容量为l.25xl05cfu。重链Fd基因与pComb3-L载体重组，Fab库容量为1.49×105cfu。将Fab抗体库混匀后，分区划线接种，随机挑取10个单克隆，提取质粒。经Xho I和Spe I双酶切，在650bp左右处可见基因片段，插入率为90%；同时经Xba I和Sac I双酶切，在650bp左右处可见基因片段，插入率为90%（图4）。Fah抗体库Fab基因插入率为81%，有效库容为1.21xl05。

2.4抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-10肽Fab抗体库富集、淘选结果

鼠源抗人乳腺癌Fab抗体库经辅助噬菌体VCSM13感染后，以MRPI/ABCCl-10肽为抗原对噬菌体抗体库进行3轮“吸附一洗脱一扩增”，结果显示第二轮产出率最高，说明第二轮时与MRPl/ABCCl-10肽结合的噬菌体已得到最佳富集（表1）。

2.5抗人乳腺癌MRPl/ABCCl-10肽Fab各级库的ELISA鉴定

对以MRPI/ABCCl-10肽为抗原淘选所获得的各级文库进行FLISA鉴定。与阴性对照比较，各级Fab抗体库的A405nm值均显著高于阴性对照（P<0.05）。由此证明经过三轮淘选，所获得的各级库均具有和MRPl/ABCCl-10肽结合的能力，其中三级噬菌体抗体库结合能力最强（图5）。

3讨论

免疫抗体库是指从经特定抗原免疫后的个体上获取特异性抗体基因信息，以此为模板构建得到的抗体库。本研究用人乳腺癌组织匀浆液免疫小鼠，从免疫后的小鼠脾组织中获取与乳腺癌相关的抗体信息。因经过抗原刺激，免疫后的抗体在机体内经历了自然选择和亲和力成熟过程，从所构建的免疫抗体库中筛选到特异性强、亲和力高的抗体得率明显提高。

目前，噬菌体抗体库技术已被广泛用于单克隆抗体的研究。Tohidkia等认为抗体库的库容量和多样性决定了抗体库的有效性，直接影响到高特异性、高亲和力抗体的获得。为保证所构建的鼠源抗人乳腺癌MRPl/ABCC1噬菌体Fab抗体库具有库容量大和多样性等特点。本研究采取了以下措施：1）小鼠经人乳腺癌组织匀浆液免疫后，取抗体滴度大于1：512的小鼠脾细胞提取总RNA，从基因来源方而保证抗乳腺癌抗体基因的丰度；2）为确保通过PCR技术扩增得到的Fab抗体基因信息的多样性，本研究从1MGT网站检索小鼠IgG重链和轻链基因序列（K链和λ链），共设计重链Fd段引物5对，轻链L引物10对。设计引物所依据的模板包括小鼠IgG各个亚型（IgGl、IgG2a、IgG2b、IgG2c、lgG3）；3）针对实验过程中出现的轻链L与pComb3载体连接效率低这一问题，本研究采用先将轻链L与T载体连接，在T-L有效库容量超过lxl05以上后，通过酶切回收获得大量轻链L基因，然后再将轻链L克隆到pComb3载体中；4）优化连接体系，保证重组子的转化效率；5）为保证抗体库的有效库容量，本研究采用多批次克隆的方式。如，每次连接转化后，均随机挑取单克隆酶切鉴定插入率，以转化效率最高的条件，进行下一批基因克隆。

MRPl/ABCCI-10肽是MRPl/ABCC1位于细胞膜外的一个线性抗原表位。从构建的鼠源抗人乳腺癌Fab抗体库中利用噬菌体展示技术筛选抗MRPl/ABCCl-10肽的Fab抗体，在得到Fab抗体表型信息的同时也将获得其基因信息。由于通过基因工程技术获得的小分子抗体具有相对分子质量小、组织穿透性强、抗原性低等优点，抗MRPl/ABCCl-10肽Fab抗体的获得，可用于研究人乳腺癌MRPl/ABCC1膜表位的功能，从细胞乃至分子水平寻找乳腺癌的特异性诊断指标和靶向治疗位点。另外，经标记的Fab抗体可用于免疫组化和流式细胞术，以检测和计数过表达MRPI/ABCCI的肿瘤细胞，为乳腺癌多药耐药的监测提供依据。