CAT为报告基因的铜绿假单胞菌启动子文库的建立及初步鉴定

冯梦蝶 洪 愉 许泽仰 毛普加 冯 金 赵继华 杨洪文 宋武战 黄 芬 井申荣 曾韦锟

摘 要：以CAT（chloramphenicol acetyltransferase，CAT）为报告基因，构建pCAT2启动子探针我体从绿脓杆菌基因文库中筛选启动子。Sau3A l酶切铜绿假单胞菌的基因组，回收（500—1 500bp）片段并与pCAT2载体连接构建铜绿假单胞菌的基因组文库，PCR鉴定文库的多样性，利用氦霉素（1 0μg/mL）和卡那霉素（50μg/mL）双抗平板筛选了l6株阳性菌株，并用PCR、测序、NCBI比对进行鉴定。构建的基因文厍的厍容鼍可达50 000个，覆盖基因全长的3.5倍，插入率达90%，具有较强的随机性。采用双抗平板进行启动子的筛选，筛选效率高达96%。获得了绿脓杆菌基因组中的9个启动子，同源性达99%以上，并对其活性进行初步鉴定，为铜绿假单胞菌基因表达调控的进一步研究奠定基础。

关键词：氯霉素乙酰转移酶（CAT）；报告基因；铜绿假单胞菌（PA）；启动子文厍

中图分类号：R37

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）06-0521-06

氯霉素乙酰转移酶（Chloramphenicol acetyl-transferase，CAT）是一种原核酶类，含有CAT的细菌暴露在氯霉素中可以使其乙酰化而失去活性，这是某些细菌抗氯霉素的主要原因，该酶能在大肠杆菌中表达，且非常稳定，是常用的报告基因之一。

铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruguzosa，PA）义名绿脓杆菌，是一种广泛存在于自然界的革兰氏阴性条件致病菌，当机体免疫机能低下时可引起多种感染。近年来，对人的致病作用明显增加，是一系列严重的化脓性感染，尤其是支气管扩张、慢性支气管炎、囊性肺纤维化等疾病继发感染的重要致病菌，是病人在住院期问感染的第3大致病菌。

细菌进入机体并生存下来需要一定的适应机制，其中涉及调控元件如启动子、增强子、终止子等。而在这些调控元件中，启动子是位于编码基因上游与RNA聚合酶识别、结合的一段特殊DNA序列，起着“开关”的作用。因此，本研究以CAT为报告基因构建了一个缺乏启动子的探针载体，构建绿脓杆菌基因组文库从中“钓取”启动子片段，并对启动子的活性进行初步鉴定，为进一步研究铜绿假单胞菌的基因调控奠定基础。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 菌株与载体

感受态大肠杆菌DH5α，铜绿假单胞菌（ATCC27853），质粒pACYC184、pPhoA、pET -MR均为昆明理工的大学基因工程与制药实验室保存，pMD18-T购自宝生物工程（大连）有限公司。

1.1.2 工具酶和主要试剂

限制性内切酶（SalI、Xho I、S（LCI、BglⅡ）、DL DNAmarker2000、DL DNAmarker5000、T4 DNA连接酶均购自宝生物工程（大连）有限公司。质粒DNA小量提取试剂盒、琼脂糖凝胶回收试剂盒购白北京庄盟国际生物基因科技有限公司。RNaseA购白生工生物工程（上海）股份有限公司。蛋白酶K购自Fermentas（加拿大）公司。Taq DNA聚合酶I购白天根生化科技（北京）有限公司。LB培养基：酵母粉5 g.胰蛋白胨10 g，NaCl 10g，定容至l L（固体加2%的琼脂）。卡那霉素、氯霉素、氨苄青霉素、PCR试剂均购白生工生物工程（上海）股份有限公司。

1.2 方法

1.2.1 CAT基因扩增

引物的设计：参考pACYC184载体中CAT序列设计引物，在引物上下游分别引入Nde I、Xho I酶切位点，引物由上海捷瑞生物工程有限公司合成，序列见表l。

目的片段的扩增：用引物1和引物2，以pA-CYC184质粒为模板，扩增CAT基因。PCR参数：94℃预变性5 min；94℃变性30 s；50 ℃复性30 s、72 ℃延伸40 s，循环35次；72℃总延伸5min。采用1.5%琼脂糖凝胶电泳检测PCR产物，小量琼脂糖凝胶试剂盒纯化目的片段。T-A克隆至pMD18-T，获得pMD18-T-CAT，用Nde I和Xho I双酶切鉴定，并送华大基因测序。

1.2.2

pCAT2载体的构建

测序正确后，Nde I 、Xho I双酶切pMD18T-CAT，回收小片段。pER-MR载体（图1）用限制性内切酶Nde I和Xho I双切，胶回收载体大片段二将两者用T4 DNA连接酶连接，转化E.coli DH5α，kan+抗性平板筛选。随机挑选平板上长出的单个菌落接种于LB液体培养基过夜培养后提质粒，双酶切鉴定。鉴定正确的载体命名为pCAT2。

1.2.3 铜绿假单胞菌基因组提取、酶切与回收

从-80 ℃冰箱中取出保存的铜绿假单胞菌，室温融化后取50μL菌液加入到盛有5 mL LB液体培养基中，37℃过夜培养至对数生长期的中晚期时收获细菌，提取细菌基因组DNA，具体过程如下：取5 mL铜绿假单胞菌12 000 r/min离心1min，沉淀用567 μL TE重悬，然后加入30 μL，10% SDS、3 μL 20 mg/mL蛋白酶K混匀，37 ℃温育l h：再加80 μL 3mol/L CTAB/NaCl允分混匀，于65℃温育10 min；加入等体积的氯仿/异戊醇混匀，l2 000 r/min离心10 min，将上清转移至新的EP管中；再加入等体积的酚/氯仿/异戊醇，混匀，12 000r/min离心10 min，将上清转移至新的EP管巾；加入0.6倍体积的异丙醇，轻轻混匀，有絮状沉淀出现，12 000 r/min离心10 min，弃上清；沉淀用70%和无水乙醇各洗一次后晾干，用100 μL TE重悬、定量。用Sau3A I酶切铜绿假单胞菌基因组DNA，最佳条件的摸索如表2所示。在最佳酶切条件下大量酶切，1.5%琼脂糖电泳回收500—1 500 bp的片段。

1.2.4铜绿假单胞菌基因组文库的构建与鉴定

将含有质粒pCAT2的大肠杆菌DH5a接种于含有50μg/mL卡那霉素的LB液体培养基中，37℃振荡培养过夜，按照质粒提取试剂盒提取质粒。pCAT2载体用BglⅡ酶切、去磷酸化，凝胶回收。采用T4 DNA连接酶将去磷酸化的载体与绿脓杆菌基因组随机片段按摩尔比为1：5的比例16 ℃过夜连接，连接产物转化到DH5α感受态中，涂布于Kan+抗性平板筛选，计数平板上的菌落。随机挑选16个菌落，以引物2和引物3进行菌落PCR扩增DNA片段，鉴定插入片段的随机性。PCR反应参数：94℃预变性15 min；94℃变性30 s；50℃复性30 s、72 ℃延伸90 s，循环35次；72 ℃总延伸I0 min。将PCR产物在含有溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶上电泳，用凝胶成像仪分析系统分析处理。

1.2.5 启动子文库的构建与筛选

收集上述平板上所有菌落于含有LB培养基的无菌EP管中，按质粒小量抽提试剂盒说明书提取质粒DNA，得到含铜绿假单胞菌基因组DNA随机片段的质粒库，即为启动子文库。然后将混合质粒转化大肠杆菌DH5α感受态，同时以没有插入制绿假单胞菌基因组DNA随机片段的空载体质粒为对照。卡那霉素（50μg/mL）和氯霉素（10μg/mL）双抗平板筛选具有启动子活性的阳性菌株。

1.2.6 启动子的鉴定

pCAT2重组质粒是缺失启动子，如果在Bgl II位点插入的DNA片段具有有启动子活性，则某些菌落能表达CAT因此能够抗一定浓度的氯霉素。经过双抗平板筛选的阳性单克隆，初步说明插入的DNA片段具有启动子的功能。随机挑选10个单菌分别接种于5 mL含有卡那霉素的LB液体培养基，37℃过夜振荡培养，抽提质粒，PCR鉴定后，用引物2和引物3进行双向测序，分析插入片段的平均长度，将测序结果上传到Internet（http：//www.ncbi.nlm.gov/BLAST/）上与铜绿假单胞菌伞基冈组序列做Blast分析。

2 结果

2.1 PCR扩增CAT

pCAT2载体包含来自于pACYC184的CA71报告基因、pBR322的复制起始位点和卡那霉素抗性基因。CAT基因的PCR结果如图2所示。PCR产物经T-A克隆至pMD18-T，经Nde I和Xho I双切，因pMD18一T载体自身含有一个Nde I酶切位点，切出 3个片段：载体骨架、预期目的片段和小片段，切出片段的大小为678 bp，符合预期值（图3）。测序结果经比埘与pACYC184的CAT序列完全一致。

2.2

pCAT2载体的鉴定

双酶切后插入pER-MR 中构成pCAT2载体重组子经Nde、Xho I双酶切后，得到两个大小不同的片段，大片段人小5.2 kh，为载体片段，小片段为插入片段，大小均符合预期值（图4），表明pCAT2载体构建成功。

2.3 铜绿假单胞菌基因组酶切条件的探索

为了获得500～1 500 bp的铜绿假单胞菌基因组DNA随机片段，用Sau3A I进行部分酶切时，需要调整酶量、反应时间以选择最佳酶切反应条件。实验摸索表明要获得500～1 500 bp的DNA片段，最适酶浓度为0.2 U/μL，反应时间l h （图5）。在此基础上进行大量酶切，胶回收500—1 500 bp范围的DNA片段。

2.4 启动子文库质量的鉴定

铜绿假单胞菌的基因组全长约为6.3 Mb，文库获得约50 000个克隆，捅入片段平均大小（900 bp），质粒文库大约覆盖基因组全长的3.5倍（50 000x900 bp/6.3 Mb/2）。随机挑取的16个阳性单克隆中，有14个克隆PCR产物含有插入片段，文库插入率达到90%左右，PCR结果见图6。随机抽取10个含有插入片段质粒的PCR产物（引物为P2、P3），其中9个质粒插入片段平均长度为约900 bp（图7）。将测序与铜绿假单胞菌基因组序列做Blast分析，结果9个片段与绿脓杆菌全基因组序列吻合，同源性99%以上，结果见表3。

3 讨论

铜绿假单胞菌是病人在住院期问再次感染的主要病原菌之一。其中代谢性疾病、血液病和恶性肿瘤的患者，以及术后或某些治疗后的患者易感染本菌。经常导致术后伤口感染，也可引起褥疮、脓肿、化脓性中耳炎等。本菌引起的感染病灶可血行播散，发生菌血症和败血症。烧伤后感染铜绿色假单胞菌严重者可死亡。

启动了探针载体是分离和测定启动子效率的主要工具，通常借助于易检测的报告基因来完成。目前在细菌研究中常用的报告基因有抗性基因和非抗性基因。为了研究铜绿假单胞菌的基因表达和调控，本研究构建了pCAT2启动子探针载体，在绿脓杆菌基因文库中筛选启动子，并成功获得9种启动子。

氯霉素乙酰基转移酶可催化乙酰CoA的乙酰基转移到氯霉素3羟基，而使氯霉素分解，从而使得宿主菌能住含有氯霉素的条件下生长。目前CAT广泛应用于哺乳细胞瞬时性表达，也可进行蛋白质印迹和免疫组织化学等方面的分析。

本研究以CAT作为报告基因，将铜绿假单胞菌基因文库构建到pCAT2载体上，使基因文库随机插入，在没有DNA片段插入时，CAT是不能表达的，只有在CAT前插入启动子，才能使其表达表现出抗氯霉素的特性。实验中利用双抗筛选出能够生长的阳性单菌，说明有铜绿假单胞菌启动子的插入，并能使CAT表达，表现出抗氯霉素的特性，初步说明插入的DNA片段具有肩动子活性。

文库的容量是衡量文库的质量的重要标准按照公式N=ln（l—P）/ln（1-f），其中N是转化成功的单克隆数，P是覆盖率，f是插入片段大小与其因组DNA大小的比值。铜绿假单胞菌基因组随机片段的平均人小约为900 bp，铜绿假单胞菌标准菌株的基因组全长约为6.3 Mb，若要求插入DNA片段在文库中出现的概率为99%，所需转化成功的菌落数约为32 227个，我们总共获得约50 000个克隆，我们构建的文库约覆盖基因的3.5 倍，并且90%左右还有随机插入片段，表明文库质量较好

本研究使用CAT作为筛选标记，用双抗来筛选.效率高达96%，从而简化了筛选过程，工作量也大幅度下降。从理论上说，文库菌在双抗平板上长出的单克隆则表明插入片段含有启动子。我们挑取9个进行测序分析，对应插入基因信息如表3所示，其中3～8号分别包含核酸外切酶、未知功能DUF1654蛋白、蛋氨酸亚砜还原酶B、谷胱甘肽过氧化物酶、3-氧代酰基-ACP还原酶，且插入方向与报告基因CAT方向一致，这与预期相符。其他4个插入片段的插入方向与CAT的方向相反。反复实验证实这些菌落在双抗平板上能够生长，甚至氯霉素的浓度为34μg/mL时仍能正常生长，因此我们推测这些插入片段中可能含有未被发现或注释的强组成型肩动子，这有待下一步验证。

综上所述，本文以pCAT2为启动子探针载体，构建了铜绿假单胞菌的随机启动子文库，在初步实验的基础上为下一步深入研究铜绿假单胞菌基因功能与调控以及致病性等研究奠定了良好基础。