番茄响应生物胁迫相关miRNA的研究进展

崔娟娟 栾雨时

摘 要：miRNA（microRNA）是一类长约22nt的非编码小RNA分子，参与植物生长发育和胁迫响应等过程。近年来，通过生物学实验和生物信息学预测两种方法，陆续发现了一些响应病毒、真菌和共生真菌胁迫的番茄miRNA。这些miRNA的研究以及amiRNA（artificial miRNA）技术的应用，将为番茄乃至其他植物病害的防治提供新的契机。

关键词：番茄；生物胁迫：miRNA：amiRNA

中图分类号：Q74

文献标识码：A

文章编号：1007-7847（2014）06-0533-06

miRNA是一类在真核生物中普遍存在的非编码小RNA分子，在转录后水平调控真核生物的基因表达。在细胞核中，miRNA基因转录生成pri-miRNA，经DCL1（dicer-like l）加工后生成具有发火结构的pre-miRNA，它被转运出细胞核后形miRNA/miRNA A*，双链解旋形成成熟的miR-NA.随后miRNA与AGO（Argonaute）等蛋白结合形成RNA诱导的沉默复合物RISC（RNA -in-duced silengcing complex），从而在转录后水平通过翻译阻遏或降解机制发挥调控作用。miRNA的种类繁多、分布广泛，于转录后水平发挥关键调节作用，在多种生物中得到广泛研究，截至2013年6月，miRBase Release 20（http：//www.mirbase.org/）中已经收录了24 521条miRNA成熟序列，主要集中在人、小鼠、拟南芥、水稻等模式生物中，而番茄中仪收录了46条，miRNA不仅调控番茄的根、茎、叶及果实发育，还参与番茄的新陈代谢、激素途径、牛物和非生物胁迫响应等过程近年来，越来越多的研究集中于挖掘并探究生物胁迫相关的番茄miRNA。生物胁迫下，每个番茄miRNA的表达模式都存在差异，它们的靶基因变化趋势与 miRNA的变化趋势有时相反，有时相同。深入研究这些miRNA的作用机制及功能将为植物病害防治提供新的思路。本文概述了挖掘生物胁迫相关miRNA的方法，系统地阐述了miRNA在番茄响应病毒和真菌胁迫过程中所发生的变化，讨论了amiRNA在提高番茄抗病性中的最新研究进展，并对miRNA在植物抗病研究中的应用进行了展望。

1 生物胁迫相关miRNA的挖掘

生物学实验和生物信息学预测是挖掘miR-NA的两种主要方法。生物学实验包括基因芯片和高通量测序两种技术。基因芯片技术是将已知miRNA固定在芯片介质上，依据碱基互补原理挖掘miRNA的一种方法。由于该方法具有快速、准确和成本较低等优点，因此，在挖掘生物胁迫相关miRNA时被广泛应用。如Jin等用芯片技术检测到了3个与灰霉病菌胁迫相关的番茄miRNA。高通量测序技术主要是通过构建小RNA文库，根据碱基序列长度、前体结构、最小自由能等参数进行筛选，获得候选miRNA的一种手段。该技术具有准确性、可靠性和通量高等优点，也是挖掘生物胁迫相关miRNA的常规手段之一。如Chen等用高通量测序技术检测到了33个与病原菌胁迫密切相关的杨树miRNA。随着生物信息技术的飞速发展和各物种基因组信息的逐步完善，高效、经济的牛物信息学控掘也成了发现生物胁迫miRNA的重要手段。生物信息学预测是依据miRNA的成熟体及前体特征，在EST、GSS及基因组序列中预测潜在的miRNA的一种方法。此方法已在马铃薯、糜子、桃等物种中得到成功应用。结合miRNA启动子、靶基因功能分析，能够预测候选miRNA的功能。通过生物信息学手段很有可能找到和生物胁迫密切相关的miRNA，但由于缺乏验证，更多的研究有待深入。生物学实验和生物信息学预测两种方法各有优劣，越来越多的研究已将二者结合，这也将成为未来发现关键病害相关miRNA的强大手段。

2 番茄miRNA与生物胁迫

番茄在生长过程中会遇到多种牛物胁迫，因此.它也是研究植物与微生物互作的模式材料之一。 随着基因芯片、高通量测序和生物信息学预洲等技术的发展，越来越多响应生物胁迫的番茄miRNA被发现，它们的表达在番茄响应病毒、真菌和共生真菌的过程中发生着不同程度的变化，现归纳于表1。

2.1 番茄miRNA与CMV和TAV

2.1.1 番茄miRNA与CMV和TAV胁迫

CMV （cucumher mosaic virus）是寄主范围最广、影响最大的植物病原物之一。Lang等用芯片技术发现了12个番茄miRNA与CMV胁迫应答相关。TAV （tomato aspermv virus）与CMV的基因组同源性很高，二者共属黄瓜花叶病毒属，但有不同的寄主和植株感病症状。为探究番茄miRNA如何响应CMV和TAV胁迫，Feng等选择了miR159、miR162、miR164、miR165/166、miR-167、m1R168和m1R17l共7个与番茄生长发育、激素信号转导途径和miRNA自身形成相关的miRNA进行研究，发现上述两种病毒处理后，这7个miRNA的表达差异明显，暗示这些miRNA可能参与番茄响应CMV和TAV的胁迫过程。

为深入探索其内在机制，Feng等进一步研究了CMV和TAV胁迫下番茄miRNA在不同处理时间后的表达特性，结果发现它们的表达变化各不相同。miR159、miR162、miR168和miR171在胁迫处理后异常表达，而miR164、miR165/166和miR167的变化甚微。在第10 d时CMV处理组较TAV处理组的miRNA有更高的表达量，第20d时两者相差不多，第30 d时TAV处理组表达量更高。此外，miR168在CMV处理后第10 d的表达量是对照的15.2倍，miR162在TAV处理后第30 d的表达量是对照的4.5倍。

miRNA在植物生长发育过程中发挥着重要调节作用，研究表明，生物胁迫处理后参与番茄生长发育的miRNA异常表达，这一现象与生物胁迫后番茄叶、果实和根等组织的病变有关。Feng等用CMV和TAV处理番茄的花和果实，发现在不同组织和协迫时期，与发育相关的miRNA异常表达。如，miR159主要在蕾期、开花期及果实发育早期；miR160在果实成熟期；miR167在开花及果实直径达1～5 mm的时期；miR172在蕾期及开花期。这些miRNA的异常表达可能诱发了胁迫处理后花和果实的病变。

基于以上进展，Feng等又研究了 CMV和TAV胁迫下，l1个番茄miRNA在根和茎中的表达特性。结果发现它们的表达特性各不相同。经CMV-Fny-satT1（加重病症的CMV）和TAV处理21 d，番茄茎部会分别出现中空和纤维化现象。其中，两种胁迫处理后miR156都表达异常，而过表达miR156a的转基因番茄会出现茎髓消失，与CMV和TAV诱发的茎中空及纤维化现象类似。因此，miR156的异常表达可能导致了番茄茎部的病变此外，经CMV和TAV胁迫处理的番茄，侧根数明显减少，而ARF （auxin response factor）与植物的侧根发育相关，研究中以ARF为靶基因的miR160、miR164和miR167均发生了异常表达的现象，说明它们诱发了番茄侧根数量的减少。

2.1.2

番茄miRNA与CMV的沉默抑制子

CMV的基因组编码5个ORF，包括la、2a、2b、3a和3 b：其中，2b是最重要的致病蛋白，也是CMV的沉默抑制子，通过抑制沉默途径的关键因子AGO蛋白活性，在病毒逃避植物免疫的过程中发挥着重要作用。Feng等的研究表明，miR168及其靶基因AGO在CMV和TAV处理番茄后，均出现上调表达的矛盾现象。然而在2h突变病毒株的处理下，相应的番茄miRNA的表达量几乎没有发生变化。说明2b在干扰番茄利用miRNA抵御CMV的过程中发挥了重要作用。其机制可能是2h抑制了AGO对miRNA靶基因的切割活性，导致靶基因大量累积，最终出现CMV和TAV胁迫下番茄miRNA及靶基因的表达整体上调的矛盾现象。

2.1.3 番茄miRNA与CMV的卫星RNA

一些CMV株系能够用病毒壳体包裹小的自剪接RNA分子，形成satRNA（satetlite RNA），它必须依赖于辅助病毒进行侵染和复制。satRNA在CMV中以不同的突变体形式存在，可以改变植物病症。据Feng等报道，在CMV和TAV胁迫下，11个miRNA及相应的靶基因发生了不同程度的异常表达一然而，当向CMV导入减弱病症的satRNA时，这些miRNA的变化不明显。与此相反，当导入携带有加重病症的satRNA时，番茄的miRNA又发生异常表达的现象。该研究暗示了satRNA在CMV 干扰番茄miRNA调控中的复杂作用。

2.2 番茄miRNA与ToLCV

ToLCV（ tomato leaf curl virus）是一类双生病毒，该类病毒变异速度快，寄主范围广，常给热带或亚热带国家和地区的农业生产带来巨大影响。Naqvi等用芯片技术检测到13个与ToLCNDV（ tomato leaf curl new delhi virus）相关的番茄miRNA，它们的靶基因表达趋势与之相反。研究还发现，经ToLCNDV处理后，多种不同番茄资源材料中的miR159/319和miR172异常表达，且这三者与叶片发育密切相关，因此，推测它们在ToLCNDV胁迫后的异常表达可能导致了番茄卷叶症状。

ToLCV以单分子DNA-A或两分子DNA-A、DNA-B闭环状ssDNiA的方式存在。DNA-A的正义链编码AV1和AV2，互补链编码AC1、AC2、AC3、AC4，共有6个ORF。 AC1编码复制相关蛋白，AC2编码转录激活蛋白，AC3编码复制增强子蛋白，AC4编码症状表达决定性的蛋白。DNA-B编码BC1和BV1，前者促进病毒在细胞间的传播，后者使新形成的病毒基因转移到细胞质。为研究番茄的miRNA是否能够靶向病毒基因，从而抑制病毒增殖，Naqvi等用生物信息学方法预测到9个番茄miR/miR*序列与ToLCV的6个不同的ORF有很高的序列匹配性。其中miR164a、miR169b*、m1R169d和miR171*靶向ToLCV的外壳蛋白14 V1基因，miR164和miRl69b*在，AVI处有交叉结合位点。4个miR/miR*靶位点都相对较近，它们可能协同作用，导致高效的AV1靶基因沉默。研究还发现一些miR*，可能也参与了抑制病毒生长的过程，如miR156*靶向AC2、AC3，miR172*靶向AV2等，这些均揭示了miR*在植物抗病中的新角色。

2.3 番茄miRNA与灰霉菌

灰霉病是导致番茄茎腐烂的重要病害之一，常造成栽培番茄的减产。Jin等用基因芯片技术检测到番茄miR169、m1R160和miR171a与灰霉病菌胁迫相关。在病菌处理后12 h，miR169上调表达，miR160和miR171a下调表达、其中，miR169的靶基因下调表达，而miR171a和miR160的靶基因均上调表达。启动子分析表明，miR169的启动子区域存在一个与许多植物基因病原诱导相关的顺式作用元件-Box-Wl，该区域也是WRKY转录因子家族的结合位点，参与创伤响应基因的表达调控，且miR169的启动子区存在创伤响应元件WUN-motif暗示miR169可能受控于转录因子，参与了创伤响应途径。

2.4 番茄miRNA与丛枝菌根

丛枝菌根是丛枝菌根真菌与植物根部组织长期进化形成的共生菌根，它在促进植物生长和抵御不良环境中发挥着积极作用，是与农业生产关系最为密切的菌根之一。Gu等用基因芯片技术研究了番茄miRNA与丛枝菌根的关系。发现miR395、miR779.1、miR840和miR867在有丛枝菌根的番茄叶片中特异性表达，miR158、miR862-3p、miR319、miR394和miR399在有从枝菌根的番茄根部异常表达这些都暗示了miRNA在番茄与丛枝真菌共生过程中发挥着调节作用。

2.5 其他

Shivaprasad等通过分析番茄小RNA数据集，发现番茄中存在miRNA介导的级联式训控，该调控途径参与番茄抗病过程。启动级联调控的miRNA超家族包括miR482和miR2118等。它们广泛存在于各种植物中。虽然miR482和miR2118家族成员之间序列差异大，但都是以包括NBS（NUCLEOTIDE-BINDING SITE）和LRR（ leucine-rich re-peat）在内的植物抗病基因家族为靶基因。其中，miR482通过降解NBS-LRR而引发级联反应，在番茄抗病过程中发挥重要作用。同时，Li等预测到miR482a、miR482b、miR482c和 miR482d在番茄染色体上成簇存在，暗示了它们可能协同作用响应生物胁迫。而miR6022、miR6023、miR6024、miR6026和miR6027的靶基因多为番茄抗病基因，更进一步表明该miRNA家族在番茄响应生物胁迫中的重要作用。以上与生物胁迫相关的miRNA，都可被选作候选miRNA分子，进行深入的致病分子机制研究和功能分析。

3 amiRNA在番茄抗病中的应用

随着miRNA的生成及作用机理研究的日渐深入，针对病原物基因设计人工miRNA的技术也随之产生。miRNA是为了在生物体内控制某一个或多个基因的表达，根据天然miRNA结构特点和作用机制，通过人工设计构建、转导并在生物体内表达而产生的目的miRNA，是调控靶基因表达的一项新的生物技术。Qu等利用miR171a的前体骨架，构建了以CMV沉默抑制子26为靶基因的amjRNA，导入后的转基因烟草能够有效抵御CMV，并且amiRNA表达量越高，转丛因烟草对CMV的抗性越强。Niu等利用拟南芥miR159前体骨架成功地构建厂两个分别以TYMV（ turnip yellow mosaic virus）和TuMV （turnip mo-saic- virus）沉默抑制子为靶基因的amiRNA，两组转基因植株都能够有效抵御TYMV和TuMV的危害。该研究还发现，同时导入这两个amiRNA的转茵番茄对TYMV和TuMV有100%的抗性。这些以病毒关键致病基因为靶基因的amiRNA都可以和正常miRNA一样在植物体内产生、成熟并发挥作用，使植物获得抗病特性，并且稳定遗传给子代。Zhang等利用南芥miR159前体骨架，设计了两个amiRNA构件，一个是amiR-2a/b：5-UUGGAGUUCGACGUUUGUCAU -3'，靶向CMV 2α （RNA依赖的RNA聚合酶蛋白基因）和2b叠基基因，另一个amiR一3UTR：5 -UGAC-CAUUUUAGCCGUAAGCU-3，靶向CMV基因的保守区域3'UTR。将这两个amiRNA导人番茄，得到了能够抵抗CMV、TMV （tobacco mosaic virus）和TYLCV （ tomato yellow leaf curl virus）等病毒的植株，并且靶向2α和2b的amiRNA，对CMV抑制效果达85.7%～100%。另外，Vu等也在番茄中成功地构建并导入了两个针对ToLCNDV的amiRNA载体。其中，amiR-AVl-3靶向ToLCV的AV1基因，amiR -AV1一l靶向AV1和AV2重叠基因。导入amiR-AVl-l的T2代转基因番茄对ToLCNDV的抗性达80%。amiRNA技术通过创造新的非天然miRNA，为植物病害治理提供了新的契机，然而由于miRNA的生成和作用机制尚未完全清楚，仍存在一些不确定因素，有待更多的实验研究。

4 展望

miRNA作为一种普遍存在于生物体内的关键调控因子，不仅参与植物的生长发育，还与响应生物胁迫密切相关。番茄是研究植物与微生物百作的模式植物之一。从番茄中挖掘与生物胁迫相关的miRNA以及在植物病害治理上应用amiRNA技术已经取得了重大突破，这些成果对番茄抗病研究具有重要意义。结合基因工程技术把天然miRNA或miRNA导入不同品种的番茄中，不但能够深入了解生物胁迫相关miRNA的分子作用机制，还可获得抗病新种质，经过高效种植技术从而提高番茄的经济效益。同叫，番茄生物胁迫相关miRNA的挖掘也会对其他植物的相关研究起到积极的推动作用。相信在不久的将来，随着人们对miRNA及amiRNA的进一步子解和掌握，将为植物病害防治提供一条全新的路线。