苹果梨果实CHI基因cDNA克隆及表达分析

孙百灵 曲柏宏 杨宏霞 鹿艳新 王雪 曹丽

摘要 以苹果梨果实为试验材料，克隆得到CHI基因cDNA序列（片段），GenBank登录号：JN120854，其长度为444 bp，推断其编码148个氨基酸序列。生物信息学分析结果表明，该氨基酸序列与其他植物CHI氨基酸序列的同源性在90%左右，与砂梨CHI氨基酸序列聚类关系最近，该CHI基因cDNA序列含有常用的限制性内切酶BamHI的识别位点。半定量RTPCR分析结果表明，随着果实的成熟，套袋果与未套袋果CHI基因的表达量都不断增加，但套袋果在果实成熟期的表达量明显高于未套袋果。

关键词 苹果梨;果实;花青苷;CHI;表达分析

中图分类号 S661.2  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2014）34-12043-03

Molecular Cloning and Expression Analysis of Chalcone Isomerase Gene from Pingguoli Fruit

SUN Bailing1， QU Baihong2，YANG Hongxia2， CAO Li2* et al

（1. Vocational and Technical Education of Weichang ManMeng Nationality Autonomous County， Chengde， Hebei 068451; 2. Agricultural College of Yanbian University， Yanji， Jilin 133002）

Abstract Pingguoli fruit was used as material in the experiment， CHI gene cDNA sequence （fragment） was cloned， accession number： JN120854， partial sequence was 444 basepair， coding 148 amino acids. Bioinformatics analysis results show that CHI amino acid sequence homology is 90% with other plant， and CHI amino acid of the Pingguoli had closer relationship with Shali， there was a commonly used restriction enzyme site for BamHI from CHI gene cDNA sequence. The semiquantitative RTPCR technique showed that as fruit mature， expression of CHI gene is increasing constantly about bagged fruit and not bagged fruit， but bagged fruit of expression obviously higher than not bagged fruit in the fruit mature.

Key words Pingguoli; Fruit; Anthocyanin; CHI; Expression analysis

果實的颜色主要取决于果实下表皮细胞中的叶绿素、类胡萝卜素、类黄酮以及花青素的含量。这几种色素在果实不同发育阶段含量不同，红色品种从生长期过渡到成熟阶段，果实的底色由绿变黄，同时在底色的基础上着生红色或紫红色。底色的变化是由于叶绿素的分解和类胡萝卜素含量的增加，而红色的产生是由于花青苷的合成[1]。

花青苷是植物体内的一类次生代谢物质，是苯丙氨酸代谢的产物，目前对花青苷形成机制和影响因素已有详细的报道[2-3]，甚至有人对花青苷生物合成的遗传和发育调控也进行了研究[4-5]。花青苷在多种酶的催化作用下合成，其中查尔酮异构酶（CHI）在花青苷合成途径中非常重要，在CHI缺乏的玉米突变体中，会出现查尔酮积累而使子粒呈古铜色。因此，笔者对苹果梨果实CHI基因的cDNA克隆及表达分析进行研究，从分子生物学角度探讨苹果梨果实着色的生理机制，为进一步探明梨果实着色的分子机理提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 试验材料

1.1.1 材料。

采用延边华龙集团果树场绿色苹果梨示范基地的苹果梨果实，取样后，果皮用锡箔纸包好，液氮速冻后，保存在-80 ℃冰箱中备用。

1.1.2 菌株和载体。

大肠杆菌DH5α为延边大学农学院生物技术实验室保存。pMD18T载体购自宝生物工程（大连）有限公司（Takara）。

1.1.3 酶和生化试剂。

EX Taq酶、普通Taq酶、反转录酶（MMLV）、dNTPs、凝胶回收试剂盒等均购自宝生物工程（大连）有限公司（Takara），引物由北京英骏生物技术有限公司合成。

1.2 试验方法

1.2.1 套袋处理及取样时期。

套袋种类选择单面蜡质的洛川双层纸袋。套袋时期为盛花后4～5周。在采前18 d进行解袋处理（双层袋，先除去外层纸袋，3～5 d后除去内层袋）。分别在果实膨大期、着色期（前期、中期、后期）、成熟期取样，未套袋的作为对照（CK）。

1.2.2 苹果梨果皮总RNA的提取及cDNA合成。

采用改良的CTAB法提取果皮总RNA，该方法分别参考Zeng等[6]、王西成等[7]、Bekesiova等[8]和Porebski等[9]的核酸提取方法改进而成。将RNA溶于30 μl的DEPCH2O中，在1.2%的琼脂糖凝胶上电泳检测总RNA的完整性，电压为5 V/cm，并用紫外分光光度计测定总RNA的A260、A280，其余置于-80 ℃冰箱中保存备用。

用宝生物工程（大连）有限公司（Takara）MMLV（RNase H-）反转录酶合成cDNA第一链，以Oligo（dT）18为反转录引物，起始RNA为3 μl 总RNA。

1.2.3 苹果梨果实CHI基因的RTPCR扩增。

对NCBI上已登录的西洋梨和砂梨栽培品种的CHI核苷酸进行多序列比对，利用Oligo 6软件设计一对特异引物，对苹果梨果实CHI基因进行RT-PCR扩增，引物序列：

上游引物5′ATGGCTCCACCACCATCGCTCGCT3′;

下游引物5′CGGTGGGAAGTTTTGATCTTTGAA3′。

PCR反应体系：25 μl 总反应体积中含模板第一链 cDNA 1 μl，上下游引物各1 μl（20 μmol/L），dNTP Mixture 1.5 μl（2.5 mmol/L），MgCl21.5  μl （25 mmol/L），Ex Taq DNA 聚合酶0.2 μl（5 U/μl），10×Buffer 2.5 μl，其余用重蒸馏水补充。

PCR反应條件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，59 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳观察特异扩增片段。

1.2.4 PCR产物纯化回收及测序。

参照TaKaRa Agarose Gel DNA Purification Kit Ver.2.0说明书进行PCR产物纯化回收，于克隆载体pMD18T连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，经蓝白斑筛选及PCR鉴定阳性克隆后，送北京英骏生物技术有限公司测序。

1.2.5 生物信息学分析。

同源性分析：借助DNA Star软件，对所得序列与Genbank上有关序列进行同源性分析，挑选典型物种序列进行多序列比对，Gene doc生成比对结果，并利用该软件对比对结果构建系统发育树，进行系统发育分析。

利用DNA Star软件确定CHI基因序列的酶切位点。

1.2.6 苹果梨CHI基因的半定量RTPCR分析。

18SrRNA进行RTPCR可以被扩增出来，且经常用作内参基因[10]，反转录后根据18SrRNA基因的表达量确定不同处理cDNA模板的相对含量，根据18SrRNA基因的扩增量，调整各处理样品的cDNA模板的绝对含量一致。对西洋梨和砂梨栽培品种的18SrRNA核苷酸进行多序列比对，设计一对特异引物，引物序列为：

上游引物5′GACTGTGAAACTGCGAATGGCTCA3′;

下游引物5′ACTATCCTACCATCGAAAGTTGAT3′。

PCR反应体系同CHI基因的RTPCR扩增。

PCR反应条件：94 ℃ 5 min;94 ℃ 45 s，54.8 ℃ 45 s，72 ℃ 1 min，35个循环;72 ℃延伸5 min。PCR产物在1.2%琼脂糖凝胶电泳观察特异扩增片段。

2 结果与分析

2.1 苹果梨果皮总RNA完整性检测

从图1可以看出，改良的CTAB法提取的苹果梨总RNA出现明显的28 s、18 s、5 s 3条带，带型规则整齐，且28 s的条带亮度是18 s的2倍，说明所提取RNA基本没有降解，结构较为完整。

2.2 苹果梨果皮总RNA的提取纯度

通过A260与A280的比值可以判断RNA的纯度，高质量RNA的A260/A280应在1.8～2.0。改良的CTAB法提取RNA的A260/A280均介于1.8～2.0（表1），说明所提取的总RNA纯度较高，浓度也较高，无蛋白质、DNA、多糖等物质的残留。

2.3 苹果梨CHI基因cDNA片段的克隆

由图2可知，将提取的苹果梨果皮总RNA反转录为cDNA，以cDNA为模板

注：1.果实膨大期;2.果实着色前期;3.果实着色中期;4.果实着色后期;5.果实成熟期。

图1 不同时期取样的套袋苹果梨果皮总RNA电泳图谱

表1 改良CTAB法提取总RNA紫外分光光度计分析结果

取样时期A260A280A260/A280

果实膨大期0.0780.0411.897 6

果实着色前期0.0670.0351.932 4

果实着色中期0.0620.0321.961 8

果实着色后期0.0820.0431.909 8

果实成熟期0.0590.0311.871 4

进行RTPCR反应，用1.2%的琼脂糖电泳检测PCR产物，发

现扩增出一条444 bp的片段，与预测目的片段的大小一致。

图2 苹果梨CHI基因的RTPCR扩增

2.4 苹果梨CHI基因多序列比对及其系统发育分析

苹果梨CHI基因片段cDNA序列经Blast比对，发现与大多数已登录的其他植物的CHI基因序列同源性在90%左右，其中与西洋梨有95%的相似度，说明已成功克隆出苹果梨CHI基因片段。将该片段cDNA对应的氨基酸序列在NCBI上运行blastp，比对结果见图3。由图3可知，它与多种植物的CHI氨基酸序列具有较高的同源性，特别是与砂梨、西洋梨的同源性分别达到95%、93%。

图3 苹果梨和其他植物的CHI氨基酸序列比对结果

利用DNA Star软件，对苹果梨CHI氨基酸序列及从GeneBank中获取的其他植物CHI氨基酸序列进行系统进化分析。从图4可以看出，苹果梨与砂梨CHI氨基酸序列聚类关系最近，预示植物CHI基因在进化过程中维系着较为保守的结构和功能。

2.5 CHI基因cDNA序列酶切位点

利用DNA Star软件确定CHI基因cDNA序列的酶切位点，结果见图5。由图5

可知，所克隆的CHI基因cDNA序列富含多酶切位点，其中

含有常用的限制性内切酶BamHI的识别位点。

图4 苹果梨与砂梨、西洋梨、苹果、桃、甜樱桃CHI基因序列的系统进化树

图5 苹果梨果实CHI基因序列的酶切位点

2.6 苹果梨CHI基因的半定量RTPCR分析

应用半定量RTPCR研究了CHI在不同取样时期的苹果梨果皮中的表达，结果见图6。由图6可知，套袋果与未套袋果CHI基因在果实膨大期、着色期（前期、中期、后期）、成熟期均能检测到，随着果实的成熟，CHI基因的表达量不断增加，但套袋果在果实成熟期的表达量明显高于未套袋果。

注：1.果实膨大期;2.果实着色前期;3.果实着色中期;4.果实着色后期;5.果实成熟期。

图6 不同取样时期套袋与未套袋果实CHI基因的表达

3 讨论

查尔酮异构酶是花青苷合成途径中至关重要的酶，其作用主要是催化查尔酮环的闭合，因此，该基因的克隆对于花青苷合成的研究非常重要。该研究首次从苹果梨果皮中克隆了CHI基因（片段），并通过半定量RTPCR技术对该基因的表达进行了分析，结果表明，套袋果在果实成熟期的表达量明显高于未套袋果，这也是利用套袋技术来促进果实着色的原因，同时，也说明CHI基因是形成苹果梨红色果皮的关键基因之一。

通过在Genebank上检索与苹果梨近缘物种的CHI基因序列，结果发现苹果梨CHI基因序列与西洋梨有95%的相似度，说明基因克隆成功。进一步对CHI基因进行多物种间亲缘进化关系的比较发现，CHI基因在不同科植物间有较大的差异性，而在同一科CHI基因的保守性很高，因此可以利用CHI基因保守性强的原理进行同一科属间基因的克隆，对于提高基因克隆的成功率具有重要意义。

42卷34期

孙百灵等 苹果梨果实CHI基因cDNA克隆及表达分析

参考文献

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