硝酸钠浓度对亚心形扁藻生长及油脂与淀粉含量的影响

王友利 杨海波 于媛

摘要

[目的] 确定硝酸钠浓度对亚心形扁藻生长及油脂和淀粉含量的影响。[方法] 以亚心形扁藻作为试验材料，以海洋微藻培养常用的普适性康维方营养液为基础，考察硝酸钠质量浓度为10 mg/L、60 mg/L、110 mg/L、160 mg/L和210 mg/L的培养基对亚心形扁藻生长及油脂和淀粉含量的影响。[结果] 当硝酸钠浓度为10 mg/L时，有利于油脂、淀粉的合成，但此时扁藻生长慢，生物量低，使得这些生物组分的总产量低;当硝酸钠质量浓度为60 mg/L时，油脂和淀粉含量较高，并且扁藻生长快，油脂、淀粉的总产量高;继续增加硝酸钠浓度时，扁藻生物量和各组分含量基本不变。[结论] 从微藻生物能源角度考虑，60 mg/L的硝酸钠质量浓度是培养亚心形扁藻的优化浓度。

关键词 亚心形扁藻;硝酸钠;油脂;淀粉;生物量

中图分类号 S968.49  文献标识码 A  文章编号 0517-6611（2014）34-12247-03

Effects of Sodium Nitrate Concentration on the Growth of Platymonas subcordiformis and the Contents of Oil and Starch

WANG Youli， YANG Haibo*， YU Yuan

（Department of Environmental and Chemical Engineering， Dalian University， Dalian， Liaoning 116622）

Abstract [Objective]] To confirm the effects of sodium nitrate concentration on the growth of Platymonas subcordiformis and on the contents of oil and starch in it. [Method] Based on the conventional Kangwei nutrient medium used in culturing marine microalgae， the concentration of sodium nitrate from 10 to 210 mg/L in an interval of 50 mg/L were investigated in increasig the biomass of P. subcordiformis and the contents of oil and starch. [Result] 10 mg/L sodium nitrate was suitable for synthesizing of oil and starch in P. subcordiformis， while P. subcordiformis grew slowly at the concentration because of the lack of nitrogen nutrient. And 60 mg/L sodium nitrate was advantageous to both the biomass of P. subcordiformis and the contents of oil and starch. When the concentration of sodium nitrate was gradually increased， the biomass and the contents changed a few. [Conclusion] From the view of microalgae bioenergy， 60 mg/L sodium nitrate is suitable for culturing P. subcordiformis and extracting oil and starch in it.

Key words  Platymonas subcordiformis; Sodium nitrate; Oil; Starch; Biomass

作者簡介

王友利（1988-），男，山东日照人，硕士研究生，研究方向：海洋微藻生物能源。*通讯作者，教授，从事海洋微藻生物能源研究。

收稿日期 20141027

亚心形扁藻（Platymonas subcordiformis）不仅是水产动物育苗过程中常用的优质饵料，而且因其油脂和淀粉含量高，近些年，逐渐受到微藻生物能源领域研究者的广泛关注[1-2]。

氮是构成海洋微藻生物体的重要元素之一，是微藻生命活动的必需物质，但不同氮源对微藻生长及其细胞内生物组分的合成有着不同影响。刘怀平等[3]的研究表明，在添加NaNO3时，网状空星藻（Coelastrum reticulatum）及栅藻（Scenedesums sp.）的单位体积总脂含量达到最高。Fan等[4]的研究发现以尿素和铵为氮源时，微型原甲藻（Prorocentrum minimum）生长速率增加。王帅等[5]研究表明，氮浓度对小球藻（Chlorella）和微绿球藻（Nannochloropsis）的非光化学猝灭（NPQ）和光化学猝灭（qP）影响显著。在低氮条件下，两种藻的荧光参数Fv/Fm、产量和NPQ均有明显下降，细胞浓度、叶绿素相对含量也均有不同程度的降低。孟迎迎等[6]的研究表明，氮元素显著影响扁藻生长、产物组成及其含量，尿素氮促进扁藻的生长，并有利于蛋白质积累，铵态氮则利于淀粉的积累。

鉴于亚心形扁藻在生物能源方面的应用潜力，该研究以海洋微藻培养常用的普适性康维方营养液为基础，研究硝酸钠质量浓度分别为10 mg/L、60 mg/L、110 mg/L、160 mg/L和210 mg/L的康维方营养液对亚心形扁藻生长及油脂、淀粉含量的影响，为该微藻在生物能源方面的应用提供基础试验依据和数据参考。

1 材料与方法

1.1  试验藻种

试验所用亚心形扁藻藻种为笔者试验室收藏保存的藻种。

1.2 试验方法及培养条件

以海洋微藻培养常用的普适性康维方营养液[7]为基础，培养液中其他营养成分不变，改变硝酸钠浓度，使最终培养液中的浓度分别为：10 mg/L、60 mg/L、110 mg/L、160 mg/L和210 mg/L。试验所用其他试剂均为分析纯。

取500 ml处在对数生长期的藻液，接种到含3 L灭菌海水的5 L锥形瓶中。每组浓度设两个平行样，在温度25 ℃，光照强度1 800 lx，光照周期12 h∶12 h的条件下进行培养。每天早、晚各摇瓶一次，以促进瓶内培养液内部的物质交换。每隔24 h测定一次生物量，绘制扁藻生长曲线;每隔48 h取一次样，测定扁藻细胞内油脂和淀粉的含量。根据不同硝酸钠浓度下扁藻生物量及细胞内油脂和淀粉含量随培养时间的变化关系确定优化硝酸钠浓度。

1.3 测定方法

1.3.1

生物量测定。藻生物量由分光光度法测定。取10 ml混匀的藻液，测定其在680 nm波长下的吸光度。

1.3.2

藻泥分离及处理。每次取300 ml混匀的扁藻培养液，在3 500 r/min下离心5 min，将藻泥均分到2个5 ml离心管内（编号分别为Ⅰ和Ⅱ），用去离子水洗涤藻泥2次，均在6 000 r/min下离心5 min，收获藻泥并称重后，反复冻融破碎细胞6次，备用。编号Ⅰ中的藻泥用于测淀粉含量，编号Ⅱ中的藻泥用于测油脂含量。

1.3.3

油脂含量的测定。油脂含量采用氯仿-甲醇法[8]测定。取“1.3.2”中编号为Ⅱ的藻泥，加入氯仿-甲醇萃取剂萃取，于旋转蒸发仪蒸干萃取剂后，称量剩余油脂质量，油脂含量的计算公式为：

油脂含量=m/M×100%

式中，m为油脂质量（mg）;M为藻泥质量湿重（mg）。

1.3.4

淀粉含量的测定。采用徐嫔等[9]的方法，将样品用乙醇、石油醚洗涤脱色和除脂后，加入过氧化氢脱去样品底色，再以80%的硝酸钙溶液作为淀粉提取剂，碘作显色剂，于570 nm处测定吸光度值，代入标准曲线，计算样品中淀粉含量，淀粉含量计算公式为：

淀粉含量=ρstvst×25×100%/（4×M1）

式中，ρst为淀粉标准溶液的浓度（0.1 mg/ml）;

vst为样品吸光度所对应的标准溶液的体积（ml）;

M1为藻泥质量湿重（mg）。

标准曲线以0.1 mg/ml淀粉标准溶液绘制，所得方程为：y=0.409 5x+0.006 3，相关系数R2=0.999 6，其中y为570 nm处的吸光度值，x为淀粉标准溶液的体积（ml）。

2 结果与分析

2.1 硝酸钠浓度对扁藻生物量的影响

氮作为生物生长的重要营养元素，除影响扁藻的生物量外，还对扁藻生物组分的合成产生重要影响，其浓度高低对微藻生长及其生物组成起至关重要的作用[10]。图1是不同硝酸钠浓度下亚心形扁藻生物量随培养时间的变化关系。

由图1中可以看出，当硝酸钠浓度为10 mg/L时，扁藻生物量明显低于其他浓度时的生物量，并且随培养时间延长，生物量基本不增加，说明氮浓度低时不利于该扁藻的生长。当硝酸钠浓度从60 mg/L上升至210 mg/L时，扁藻生物量几乎呈直线上升，说明在这些浓度下扁藻能够快速地进入对数生长期，至培养20 d时基本进入平衡期，生物量增至最高。由图1还可见，硝酸钠浓度为60 mg/L时的扁藻生物量与其他3种高硝酸钠浓度时的生物量在培养的前15 d几乎相等，只是在培养至20 d后才略微低于后者，说明扁藻对硝酸钠的需求有合适的浓度，一味增加其浓度，并不能有效提高扁藻生物量。图1结果表明浓度60 mg/L的硝酸钠对扁藻生长是有利的。

图1 不同浓度硝酸钠对亚心形扁藻生长的影响

2.2 硝酸钠浓度对扁藻细胞内油脂含量的影响

单位体积油脂产量是衡量微藻生物能源化潜力的指标之一，它与微藻的生物量和油脂含量均有关[11]。图2显示了不同硝酸钠浓度下扁藻油脂含量随培养时间的变化趋势。

图2 不同浓度硝酸钠对亚心形扁藻油脂含量的影响

由圖2可见，当硝酸钠浓度为10 mg/L时，亚心形扁藻细胞内的油脂含量明显高于其他浓度时的含量。随着氮浓度升高，油脂含量随之下降，当浓度达到110 mg/L时，油脂含量达到最低，之后油脂含量随着氮浓度的增加而略有增加，但变化不大。当硝酸钠浓度为60 mg/L时，油脂含量仅次于硝酸钠浓度为10 mg/L时的含量，结合图1中的扁藻生物量变化趋势可见，为获得较高的油脂产量，选择硝酸钠浓度为60 mg/L是比较有利的。由图2还可见，在扁藻培养初期油脂含量较高，随着培养时间的延长，油脂含量缓慢下降。因此，为获得较高的油脂产量，在扁藻的快速生长期收集藻泥较好。孙育平等[12]的研究表明，亚心形扁藻在低氮、低磷条件下比高氮、高磷条件下生长得好，当氮质量浓度为80 mg/L，磷质量浓度为8 mg/L时，亚心形扁藻相对生长指数和平均生长率最大。该研究结果与其基本一致。而姜永和等[13]的研究认为，含50 mg/L硝酸钠的培养液适合于扁藻生长和油脂合成。

Lee等[1]的研究表明，在非限制或高氮浓度下，微藻体内蛋白质等大量合成，可以得到总生物量或某种成分的最大生成量，虽然油脂的合成量有所增加，但不会得到较高的油脂含量。最适氮质量浓度上的微小差别，可能是与试验前的浓度设置有关。综合这些研究结果可见，硝酸钠浓度在50～80 mg/L范围内时比较有利于扁藻生长及油脂合成。

图3 不同浓度硝酸钠对亚心形扁藻淀粉含量的影响

2.3 硝酸钠浓度对扁藻细胞内淀粉含量的影响

淀粉是绿色微藻细胞光合作用的产物，其经过发酵产生的乙醇可以用作生物燃料。淀粉含量的多少也可以作为衡量微藻生物能源化的一项指标。图3显示了不同硝酸钠浓度对亚心形扁藻细胞内淀粉含量的影响。

由图3可见，随着硝酸钠浓度增加，亚心形扁藻细胞内的淀粉含量逐渐降低，这是因为在营养盐充足的情况下，微藻细胞生长旺盛，细胞器大量增殖为繁殖做准备，而不会大量合成储能物质占据胞内空间，细胞自主将胞内糖类外运，从而导致了细胞体内淀粉含量的下降。虽然硝酸钠质量浓度为10 mg/L时的淀粉含量最高，但同样因为此时扁藻生物量低的原因，导致无法获得较高的淀粉产量。Giuliano等[14]研究了营养限制对微藻淀粉积累的影响，其结果表明当氮源耗尽时，微藻细胞的生长速度明显慢于氮源充足时的速度，但有利于微藻细胞内淀粉的积累。该试验结果同样说明了这一点。

3 结论

氮是微藻生长必需的重要营养元素之一，其浓度直接影响微藻的生长及其组分的合成。该试验以可做生物能源潜在资源的亚心形扁藻为试验对象，研究了不同硝酸钠浓度对亚心形扁藻生长及细胞内油脂和淀粉含量的影响。结果表明，为获得较高的油脂和淀粉含量，硝酸钠浓度可控制在50～80 mg/L范围内，并且应在培养的快速生长期收获藻泥。

参考文献

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