反相高效液相色谱法同时测定3种抗癫痫药物的血药浓度

陈德志，陈巧辉，陈翠萌，王佳坤，甘惠贞

（中国人民解放军第180医院药学科，福建 泉州 362000）

咪达唑仑、硝西泮、地西泮等为治疗癫痫病常用药物，但此类药物的“治疗窗”较窄，低于治疗窗则疗效较差，高于治疗窗则会出现不良反应，甚至死亡[1]，故需制订合理的给药方案，使血药浓度控制在有效范围内。对此，笔者试图建立了一种能够同时测定咪达唑仑(MID)、硝西泮(NZP)、地西泮(DZP)3种药物血药浓度的方法，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（美国Waters公司，包括510泵、7725i进样器、996二极管阵列检测器）；Empower数据处理系统；XW－80型旋涡混合器(上海医科大学仪器厂)；TGL－16G型台式高速离心机(上海医用分析仪器厂)；80－2型离心机（上海手术器械厂）；AE－240型电子天平(梅特勒－托利多仪器有限公司)；pHS－3C型pH计(上海雷磁仪器厂)；TG－328B型电光天平（上海医用激光仪器厂）；SYZ－550型石英亚沸高纯水蒸馏器（江苏丹阳门石英玻璃厂）；GM－0．15Ⅱ型津腾隔膜真空泵（天津市腾达过滤器件厂）。咪达唑仑对照品（批号171250－200401），硝西泮对照品（批号 1217－9201），地西泮对照品（批号 171225－200302）；供试品均由中国药品生物制品检定所提供；甲醇为色谱纯，其他试剂均为分析纯。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Symmetry shield RP18柱（250 mm × 4．6 mm，5．0 μm）；流动相：甲醇 － 磷酸盐缓冲液（55 ∶45，v／v，pH ＝2．15）；流速：0．9 mL ／min；检测波长：230 nm；柱温：26 ℃ 。在此色谱条件下 3 种药物 MID，NZP，DZP能够达到基线分离，其保留时间分别为3．782，13．555，22．405 min。

2．2 生物样品处理

取待测血浆样品0．5 mL，加入磷酸盐缓冲液(pH 7．5)400 μL、乙酸乙酯 3 mL和石油醚 100 μL，涡旋振荡提取 3 min，转速4 000 r／min离心 5 min，吸取有机相 2．5 mL，置 55℃水浴氮气流吹干，残渣用 100 μL 甲醇 － 水(50 ∶50，v／v)溶解，涡旋振荡 5 min，转速 10 000 r／min离心 5 min，取上清液 20 μL进样。

2．3 最佳样品处理条件

采用正交试验的方法，选择缓冲液 pH（因素 A）、提取溶剂（因素 B）、涡旋时间（因素 C）、水浴温度（因素 D）为考察因素，根据 L9(34)正交试验表，考察不同因素的不同水平对提取效率的影响，按2．2项下方法及表1进行操作分析。

表1 正交试验因素水平表

由正交试验数据得最佳样品处理条件：水浴温度为55℃；提取溶剂为乙酸乙酯＋石油醚；缓冲液pH为7．5；涡旋时间为5 min，见表 2。

2．4 方法学考察

标准曲线绘制：精密称取 MID，NZP，DZP 约 1．0 mg，用适量甲醇溶解并定容至 10 mL，得供试品标准贮备液，置4℃冰箱保存。取空白血浆数份，分别精密加入适量 MID，NZP，DZP标准贮备液，均配制成质量浓度分别为 20，50，100，500，1 000，2 000，4 000 ng／mL的供试品溶液。模拟含药血浆样品，按 2．2项下方法操作分析。以 MID，NZP，DZP血药浓度（X）对相应峰面积（Y）进行线性回归，得标准曲线方程分别为 YM＝125 XM＋3 070（r＝0．999 6），YN＝123 XN＋8 440（r＝0．999 9），YD＝255 XD＋15 400（r＝0．999 7）。结果表明，MID，NZP，DZP 质量浓度的线性范围均为 20～4 000 ng／mL。

表2 正交试验结果

回收率试验：取空白血浆数份，分别配制成50，500，4000 ng／mL的模拟含药血浆样品各5份，按2．2项下方法操作测定，结果见表3。

表3 回收率及精密度试验结果（n＝5）

精密度试验：取空白血浆数份，分别配制成50，500，4000 ng／mL的模拟含药血浆样品各5份，按2．2项下方法操作。将配制好的每组样品混合后，1日内不同时间进样5次测定日内差。然后5 d内每天进样1次，测定日间差。结果见表3。

2．5 最低检测浓度

当信噪比（S／N）＝3时，本法最低检测质量浓度 NZP，DZP为 10 ng／mL，MID 为 20 ng／mL。

3 讨论

近年来采用高效液相色谱法(HPLC)测定相关药物的含量应用较为广泛，但现有报道的研究多是对某一种药物的测定[2－3]。也有采用梯度洗脱，或采用2种流动相分别洗脱[1]同时测定多种药物的HPLC法，而本法只采用单种流动相同时测定多种药物，更为简单、快速。

提取溶剂的选择：多采用有机溶剂萃取法。采用乙醚提取，其容易挥发，对人体有害；采用二氯甲烷[4]提取时，提取层在下层，不易吸取；采用乙酸乙酯提取效果好，萃取NZP，DZP效率分别为二氯甲烷的 1．63，1．02 倍，为乙醚的 1．1，1．5 倍，且毒性小，操作简便，因而选择乙酸乙酯作提取溶剂。在正交试验中，乙酸乙酯加入石油醚后可降低蛋白质等杂质峰的影响，且不影响萃取效率，测定结果准确。

萃取时涡旋时间的选择：试验中发现，涡旋时间太长容易导致乳化。本研究中选择涡旋5 min，不易出现乳化现象，且缩短了样品预处理时间，回收率也能满足研究的要求。

流动相的选择：文献中流动相有甲醇－乙腈－正己烷、磷酸盐缓冲液－乙腈等，乙腈价格昂贵，且毒性较大。预试验表明，以甲醇 － 磷酸盐缓冲液（55 ∶45，v／v，pH 2．15）为流动相，可达到较好的分离效果且所有组分保留时间均在23 min内；但磷酸盐缓冲液可能影响色谱柱的寿命，因此流动相有待改进。

检测波长的选择：本试验在190～600 nm波长范围内在线扫描，通过参考相关文献，比较了 220，230[5]，240[6]，254 nm[7－8]等波长，鉴于咪达唑仑较其他几种药物灵敏度相对偏低，而在230 nm波长处吸收值较大，且该波长下内源性干扰小，有利于药物浓度较低时的检出，因此选择230 nm作为检测波长。

本试验对每个药物标准曲线浓度范围都设计了较高的浓度，大大超过了治疗范围的上限，目的是当遇到可能误服或意外超大剂量用药的患者，能够即时作出准确的检测。

本研究方法可同时测定3种药物的血药浓度，操作简便，为医院常规监测提供了有效手段。

参考文献：

[1]徐 霞，李惠芝，吴 芸，等．反相高效液相色谱法测定7种苯二氮类药物的研究[J]．西南师范大学学报:自然科学版，2007，32(2)：35－40．

[2]费 燕，林秀丽，胡永狮，等．柱前衍生－HPLC法测定人血清中丙戊酸钠的方法改进[J]．东南国防医药，2010，12(5)：418 －419，426．

[3]尤君芬，徐仙娥．FPIA法与HPLC法测定苯妥英钠血药浓度的对比[J]．海峡药学，2010，22（4）：155 －157．

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[6]陈云红，王玉梅，平 安，等．反相高效液相色谱法测定茶碱、卡马西平和苯妥英的血清浓度[J]．南京部队医药，1998（3）:26－27．

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[8]路 伟，王大果，蒋大义，等．高效液相色谱法与荧光偏振免疫法测定3种抗癫痫药血清浓度的相关性比较[J]．中国药房，2006，17（12）：921 － 922．