反相高效液相色谱法测定胖血藤中大黄素和大黄素甲醚含量

薛朝金，陶 凯

（1．贵州省毕节市食品药品检验所，贵州 毕节 551700； 2．贵阳中医学院，贵州 贵阳 550002）

胖血藤为蓼科植物毛血藤 Polygonum cynanchodiis Hemsl．的干燥根，别名有荞麦蔓、毛血藤、云扣莲、荞叶细辛，广泛分布于湖北、四川、贵州等省，生长于河岸或山沟草丛中[1]。该药材已收载于2003年版《贵州省中药材、民族药材质量标准》，具有敛肺止咳、行气健胃、祛风除湿的功效，主要用于肺痨咳嗽、痰中带血、白日咳、胃脘胀闷疼痛、风湿痹痛[2]。该质量标准只规定了来源、性状、性味归经、功能主治、用法用量及贮藏。该药材为贵州省少数民族用药，其分布广、药用价值高，目前未发现有对胖血藤含量测定方法研究的报道。为保证药材质量和疗效，笔者建立了其含量测定方法，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（Waters 1525二元高压梯度泵，2487 Dual λ absorbance Detector，柱温箱，Breeze色谱工作站；岛津 LC－20AD二元高压梯度泵，SPD－M20D二级管阵列检测器）；AB265－S型电子天平（瑞士 Mettle Toledo公司）。大黄素对照品（批号为110756－200110）、大黄素甲醚(批号为 110758－200610)，均购自中国药品生物制品检定所；甲醇为色谱纯（美国天地公司），水为自制超纯水，其他试剂均为分析纯。试验所用的3批胖血藤药材经毕节市食品药品检验所汪勋副教授鉴定为蓼科植物毛血藤Polygonum cynanchodiis Hemsl．的干燥根。

2 方法与结果

2．1 色谱条件与系统适用性试验

色谱柱：Diamonsil C18柱（250 mm ×4．6 mm，5 μm）；流动相：甲醇 －0．1% 磷酸（80 ∶20）；流速：1．0 mL ／min；柱温：30 ℃ ；检测波长：254 nm；进样量：20 μL。在此色谱条件下，大黄素、大黄素甲醚与其他组分分离度良好，色谱图见图1。

2．2 溶液制备

图1 高效液相色谱图

精密称取大黄素对照品10 mg，加甲醇稀释至25 mL，精密称取大黄素甲醚对照品13 mg加甲醇稀释至100 mL，即得对照品贮备液，备用。精密称取样品0．5 g，置具塞锥形瓶中，精密加甲醇50 mL，精密称定质量，于水浴上加热回流 1 h，放冷，加甲醇补足减失的质量，用0．45 μm的滤膜滤过，取续滤液，即得供试品溶液。

2．3 方法学考察

线性关系考察：取对照品贮备液适量，分别制成含大黄素5，10，20，40，80 μg ／mL，含大黄素甲醚 1．562 5，3．125，6．25，9．375，12．5 μg ／mL 的混合溶液，精密吸取 20 μL，注入高效液相色谱仪，按拟订色谱条件分别测定峰面积。以对照品进样量（X，μg）为横坐标、峰面积(Y)为纵坐标进行线性回归，得大黄素回归方程Y＝4×106X＋11 534(r＝0．999 9)，大黄素甲醚回归方程 Y＝3×106X － 1 340．2(r＝0．999 7)。结果表明，大黄素、大黄素甲醚进样量分别在 0．100 0 ～1．600 0 μg和 0．031 25 ～0．250 0 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

精密度试验：精密吸取质量浓度为20 μg／mL的大黄素和质量浓度为6．25 μg／mL的大黄素甲醚混合对照品溶液，按拟订色谱条件，连续进样6次测定峰面积。结果大黄素对照品峰面积的RSD为0．55%，大黄素甲醚对照品峰面积的 RSD为1．40%，表明仪器精密度良好。

重复性试验：取同一批次的胖血藤药材6份，每份0．5 g，精密称定，按2．2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定。结果胖血藤中大黄素和大黄素甲醚的大黄素平均含量分别为0．24%和 0．059%，RSD 分别为 1．17%和 1．35%，表明方法重现性良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，精密吸取20 μL，分别在0，2，4，8，12，24 h 时进样测定。结果大黄素峰面积的 RSD 为 0．78% ，大黄素甲醚峰面积的 RSD为1．56%，表明供试品溶液在24 h内稳定。

检测限与定量限确定：采用信噪比法，把已知质量浓度的供试品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较。以信噪比为3∶1时为检测限，计算得大黄素的检测限为2．4 ng，大黄素甲醚的检测限为3．25 ng；以信噪比为10∶1时为定量限,计算得大黄素的定量限为8 ng，大黄素甲醚的定量限为14．625 ng。

加样回收试验：取已知含量（大黄素 0．24%，大黄素甲醚0．062%）的胖血藤粉末（过 4号筛）约0．25 g共6份，精密称定，置锥形瓶中分别精密加入大黄素对照品溶液 15 mL（40 μg／mL）、大黄素甲醚对照品溶液 15 mL（12．5 μg ／mL）和甲醇 20 mL，称定质量，水浴回流 1 h，放冷，用微孔滤膜（0．45 μm）滤过，取续滤液，按拟订色谱条件测定含量，计算回收率。结果见表1。

表1 大黄素与大黄素甲醚加样回收试验结果(n＝6)

2．4 样品含量测定

按2．2项下方法制备供试品溶液，按拟订色谱条件测定3批样品中的大黄素和大黄素甲醚的含量。结果见表2。

表2 不同批次胖血藤药材大黄素和大黄素甲醚含量测定结果

3 讨论

被测成分：根据植物的亲缘关系，相同科属的植物可能含有相同化学成分的特点，初步推断胖血藤可能含大黄素等蒽醌类化合物。因此先采用薄层色谱法[3]对其进行薄层分析，结果在与大黄素、大黄素甲醚对照品相同位置显相同颜色的斑点，初步证实胖血藤药材中含有大黄素和大黄素甲醚。采用高效液相色谱－二极管阵列检测器检测，结果在与大黄素、大黄素甲醚对照品相同保留时间处有相对应的色谱峰，并且相对应的色谱峰的紫外－可见光谱图一致，确定胖血藤药材中含有大黄素及大黄素甲醚。

检测波长：大黄素及大黄素甲醚（甲醇溶解）在222，254，310 nm波长处有最大吸收。当选用222 nm为检测波长时，其他成分的吸收大，使得大黄素和大黄素甲醚峰的显示相对较小而不明显；而选择310 nm为检测波长时基线不稳定，有干扰；选择254 nm为检测波长时，基线稳定，分离效果较好。因此选择254 nm作为其检测波长。

流动相：曾经用水和甲醇为流动相，结果峰形太差，无法进行积分计算。然后改用甲醇 － 0．1% 磷酸（80 ∶20）[3]为流动相，基线稳定，色谱峰峰形较好，分离度满足要求，因此确定流动相用甲醇 － 0．1% 磷酸(80 ∶20)。

提取条件：分别比较了不同提取溶剂（甲醇、乙醇），不同提取方法（加热回流提取和超声提取），不同提取时间（0．5，1，1．5 h），最后确定采用甲醇加热回流提取1 h，胖血藤中大黄素和大黄素甲醚的含量达到最大。

参考文献：

[1]全国中草药汇编编写组．全国中草药汇编(下册)[M]．北京:人民卫生出版社，1978:146．

[2]贵州省药品监督管理局．贵州省中药材、民族药材质量标准[M]．贵阳:贵州科学技术出版社，2003:288．

[3]国家药典委员会．中华人民共和国药典（一部）[M]．北京：中国医药科技出版社，2010:22．