高效液相色谱法同时测定抗脑衰胶囊中3种成分含量

2014-04-28贾永亮韩桂茹李晓燕

中国药业 2014年1期

贾永亮，韩桂茹，李晓燕

（1．河北省盐山人民医院药剂科，河北沧州 061300； 2．河北省食品药品检验院，河北石家庄 050011；3．河北以岭医药研究院，河北石家庄 050035）

目前，中药复方提取制剂的质量控制方法多是单成分的定量测定[1－3]，一个含 3 项含量测定的质量检测[4－5]，至少需 3 d，费时、费力、费资，制约着多组分定量测定质量标准的提高。为寻求高效率、低成本、一测多评的快速测定方法，笔者对抗脑衰胶囊（由熟地黄、制何首乌、人参、黄芪、白芍、远志、茯神、石菖蒲、酸枣仁、卵磷脂、枸杞子、葛根、丹参、黄芩、维生素 E等21味药物组方）进行了多组分同时定量测定研究。虽有文献报道抗脑衰胶囊中葛根素和二苯乙烯苷的测定[6]方法，但要求用Nova－Pak C18色谱柱，在320 nm波长下检测2种成分含量，葛根素因处于吸收峰的尾端，灵敏度低。笔者首次采用等度洗脱、普通C18反相色谱柱同时测定葛根素、芍药苷、二苯乙烯苷的含量，现报道如下。

1 仪器与试药

高效液相色谱仪（岛津 LC－10ADVP泵、SPD－M10AVP二极管阵列检测器、CLASS－VP LC色谱工作站）。抗脑衰胶囊（石家庄四药有限公司，批号为 050104，041069，041071），葛根素对照品（批号为110752－200511，供含量测定用），芍药苷对照品（批号为110736－200526，供含量测定用），二苯乙烯苷对照品（批号为110844－200404，供含量测定用），均购自中国药品生物制品检定所。流动相所用试剂为色谱纯，其他试剂、试药均为分析纯，水为超纯水。

2 方法与结果

2．1 色谱条件

色谱柱：用十八烷基硅烷键合硅胶为填充剂；流动相：乙腈－0．1%磷酸（12 ∶88）；检测波长：230 nm；柱温：室温；流速：1．0 mL ／min。理论板数按芍药苷峰计算应不低于2 000。

2．2 溶液制备

分别精密称取葛根素、芍药苷和二苯乙烯苷对照品适量，加30%甲醇制成每 1 mL含葛根素 0．01 mg、芍药苷 0．015 mg、二苯乙烯苷0．013 mg的溶液，作为对照品溶液。取装量差异项下的本品内容物，研细，取约0．11 g，精密称定，置容量瓶中，加 60%的甲醇20 mL，超声处理10 min，用60%甲醇稀释至刻度，摇匀，滤过，作为供试品溶液。取缺少葛根或白芍或何首乌的样品，按供试品溶液方法制备阴性对照品溶液。

2．3 测定波长选择

采用日本岛津公司生产的二极管阵列高效液相色谱仪，对样品和对照品的高效液相色谱峰分别进行光谱扫描。结果表明，葛根素在紫外区有3个吸收峰，且对照品和供试品波峰一致，分别在200，250和305 nm波长处；芍药苷有2个吸收峰，且对照品和供试品波峰一致，分别在200和230 nm波长处；二苯乙烯苷有2个吸收峰，且对照品和供试品波峰一致，分别在213和320 nm波长处。从3种成分的光谱图可见，其共有的最佳吸收在230 nm波长处，该处正是芍药苷的最大吸收波长；对于葛根素和二苯乙烯苷，该处正是二者的吸收交叉点，虽不是其最大吸收波长，但也均处于较高的吸收处，故拟以230 nm为三者的共有测定波长，见图1。

2．4 方法学考察

阴性干扰试验：分别精密吸取对照品溶液、供试品溶液和阴性对照品溶液各10 μL，注入高效液相色谱仪测定。结果对照品溶液与供试品溶液色谱峰保留时间一致，阴性无干扰，见图2。

图1 3种成分光谱扫描图

线性关系考察：分别精密称取葛根素、芍药苷和二苯乙烯苷对照品适量，加 30%的甲醇制成每 1 mL含葛根素 2．17，5．43，1．357，33．92，50．88 μg，含芍药苷 3．74，9．34，23．36，58．40，146 μg，含二苯乙烯苷 2．82，7．04，17．6，44，110 μg 的溶液。各进样20 μL，测定其峰面积。以峰面积积分值（Y）为纵坐标、进样量（X）为横坐标绘制标准曲线，得回归方程 Y葛＝3 673 540 X＋9 137（r＝ 0．999 8），Y芍＝1 494 009．4 X ＋ 2 859（r＝0．999 9），Y二＝2 473 263．6 X ＋46 441(r＝0．999 7)。结果表明，进样量葛根素在 0．043 4 ～ 1．018 μg、芍药苷在 0．074 8 ～ 2．92 μg、二苯乙烯苷在0．056 4～2．2 μg范围内与峰面积呈良好线性关系。

图2 高效液相色谱图

精密度试验：取同一对照品溶液，各进样5次，测定峰面积。结果峰面积平均值葛根素为 932 898(RSD为 0．88%)，芍药苷为 645 014(RSD为 0．67%)，二苯乙烯苷为 874 332(RSD为 1．22%)，表明仪器精密度良好。

稳定性试验：取同一供试品溶液，每隔3 h进样1次，考察18 h内的稳定性。结果峰面积平均值葛根素为831 047(RSD为1．02%)，芍药苷为 553 830(RSD 为 1．57%)，二苯乙烯苷为550 308(RSD为 1．16%)，表明供试品溶液中葛根素、芍药苷、二苯乙烯苷在18 h内稳定。

重复性试验：按高、中、低3个剂量，取同一批（批号为041069）样品6份，按2．2项下方法及拟订色谱条件进行提取，制备，测定。结果平均含量葛根素为 2．08 mg／g(RSD 为 1．16%)；芍药苷为 1．95 mg ／g(RSD 为 1．36%)，二苯乙烯苷为 3．17 mg ／g(RSD为2．32%)，表明方法重复性良好。

加样回收试验：取已知含量的同一批（批号为041069）样品6份，每份0．055 g，按高、中、低 3个剂量分别加入一定量的对照品，按拟订方法处理进行提取、制备、测定，计算回收率。结果见表 1。

表1 葛根素、芍药苷、二苯乙烯苷加样回收试验结果(n＝6)

色谱柱耐用性试验：取同一（批号为041069）供试品溶液，选用不同厂家、不同型号的色谱柱进行测定。结果3种色谱柱的测定结果基本一致，表明3种成分分离良好，见表2。

表2 不同色谱柱测定的同一样品含量(mg／g)

2．5 样品含量测定

取3批样品，依法制备供试品溶液并测定含量。结果见表3。

表3 样品中葛根素、芍药苷和二苯乙烯苷的含量测定结果(n＝3)

3 讨论

已有其他样品中葛根素与芍药苷含量测定的研究，但因组方不同，测定方法各异，有单独测定[7－8]，也有采用同一流动相在240 nm或230 nm波长下同时测定[9－10]，前者比后者多花费1倍的时间与试剂。其他样品中葛根素与二苯乙烯苷含量测定的研究多采用梯度洗脱，在各自最大波长下同时测定[11－12]，要求仪器必须配备梯度洗脱与二极管阵列检测器，仪器的性能、成本提高，应用受限，难以普及。虽然有同时测定芍药苷与二苯乙烯苷的报道[13]，但是与其他成分一同测定的，在230 nm检测波长下要经7次梯度变换，波峰基线平稳度不好。目前尚未见同时测定葛根素、芍药苷与二苯乙烯苷3种成分的报道。

本研究采用岛津高效液相SPD－M10AVP二极管阵列检测器，同时考察了葛根素和二苯乙烯苷在各自最大波长250，320 nm和共有测定波长230 nm下的线性相关系数，结果显示，二者在各自最大波长和共有测定波长下基本一致，而且同一供试品在各自最大波长和共有测定波长下测定的含量无差异。因此，采用230 nm为检测波长，只需一台带紫外检测器的普通色谱仪，即可准确进行3种中药所含3类性质各异的成分的定量测定，成本低，效率高，值得推广。

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