三脑室底型颅咽管瘤骨膜蛋白表达及其与下丘脑功能的关系☆

陈铭 刘忆 曹永福 潘军 石瑾 汪潮湖 万仁宽 冯展鹏 殷春梅 漆松涛

三脑室底型颅咽管瘤骨膜蛋白表达及其与下丘脑功能的关系☆

陈铭*刘忆*曹永福*潘军*石瑾*汪潮湖*万仁宽*冯展鹏*殷春梅*漆松涛*

目的 探讨骨膜蛋白（Periostin，POSTN）在三脑室底内型颅咽管瘤中表达及意义。方法回顾性分析42例手术病理证实的成釉细胞型且外科分型为三脑室底内型的颅咽管瘤患者资料，对其病理切片进行POSTN免疫组化染色，分析染色程度和肿瘤与三脑室底粘连程度、术后下丘脑功能和复发情况的关系。结果POSTN表达于颅咽管瘤间质成分，表达程度和术后复发率无统计学意义（Z=-0.236，P=0.813），但和肿瘤与三脑室底粘连程度（r=0.685，P＜0.001）、术后下丘脑评分（r=0.569，P＜0.001）及术后随访期BMI（r=0.594，P＜0.001）有相关性。结论POSTN反映三脑室底内型颅咽管瘤和下丘脑粘连程度，其高表达预测着更差的下丘脑功能状态。

颅咽管瘤 骨膜蛋白 下丘脑 预后

骨膜蛋白（Periostin，POSTN）又称成骨细胞特异性因子2，是一个相对分子质量为9.3×104的高分子糖蛋白[1-3]，高表达于富含胶原的组织中，如细胞外基质。在肿瘤组织中，POSTN多表达于肿瘤间质成分，在肿瘤侵袭、转移中起重要作用[4,5]。颅咽管瘤是鞍区最常见肿瘤之一，外科分型将其分为鞍膈下型（Q型），鞍上脑室外型（S型）和三脑室底内型（T型）[6]。其中，三脑室底内型颅咽管瘤患者，术中肿瘤和三脑室底的粘连程度有所不同。部分患者粘连较轻，而相当一部分患者肿瘤和三脑室底组织粘连严重，导致术后出现较严重并发症。POSTN在颅咽管瘤表达情况尚不明确，其表达情况是否与三脑室底粘连程度和预后存在相关性，尚不得知。本研究回顾性分析颅咽管瘤组织POSTN表达情况及其与患者预后的关系，探索POSTN在颅咽管瘤中的临床意义。

1 资料和方法

1.1 一般资料选取我院2006年1月至2011年1月收治资料完整的初发成釉上皮型颅咽管瘤患者73例。根据颅咽管瘤外科分型，选取其中三脑室底内型（T型）患者42例，其中男25例，女17例，年龄8～59岁。所有患者开颅行手术切除，所有病例显微镜下手术操作由南方医院神经同一手术组完成，并进行光盘刻录存档。通过术者术中判断和术后磁共振成像复查证实均达到全切除。手术标本经过脱水以及石蜡包埋后，切成4μm厚度白片待用。

1.2 成釉上皮型颅咽管瘤细胞以及相关成纤维细胞培养

1.2.1 成釉上皮型颅咽管瘤细胞培养 以下步骤均在超净台内操作。将颅咽管瘤标本置于无菌培养皿中，用PBS清洗标本，洗去表面血液，用无菌镊撕去坏死组织。无菌镊夹取组织放入无菌标本瓶中，用无菌剪刀剪碎组织至1mm3。加2 mL的DMEM培养基入瓶中，继续用无菌剪刀剪碎标本。之后，向无菌标本瓶中加入2 mL DMEM与2 mL 0.25%胰蛋白酶（根据肿瘤体积大小，保持肿瘤体积、DMEM培养基与0.25%胰蛋白酶比例为1:2: 1），吹打均匀后全部移入14mL离心管中，置于摇床上摇匀，充分反应40min（肿瘤体积较大时，可适当延长至1h）。随后，用移液器吸取混悬液，通过无菌滤网滤过液体于50mL离心管中。无菌镊夹取滤网上的组织碎片入25cm2培养瓶中，用移液器枪头均匀涂抹组织碎片于瓶壁，培养瓶置于37℃，5%CO2恒温培养箱中培养4～6 h后加入含胎牛血清DMEM继续培养。其后，用含有胎牛血清DMEM中和之前滤入50mL离心管细胞悬液中的胰蛋白酶，1000 r/min离心5min。弃去上清，用DMEM培养基重悬，接种入含胎牛血清DMEM培养基的培养皿中。以上培养瓶及培养皿中细胞均于24h后换液。

1.2.2 成纤维细胞培养 当颅咽管瘤细胞生长密度达到70%以上时，用磷酸盐缓冲液（Phosphate Buf fer Solution，PBS）洗净细胞，弃去PBS后加入0.25%胰蛋白酶并使其流过瓶内所有细胞表面，大约15s后吸出胰酶，并用含血清DMEM终止消化，离心、去上清，重悬后种于培养皿中，置于37℃，含有5%CO2培养箱中培养。

1.3 颅咽管瘤切片HE染色常规脱蜡，梯度酒精脱水处理；苏木素染色8min，流水冲洗后1%盐酸酒精分色，稍水洗返蓝，磷酸盐缓冲液漂洗5min；伊红染色1min；常规脱水、透明、中性树脂封片，显微镜下观察，拍照。

1.4 颅咽管瘤细胞与成纤维细胞鉴定以及POSTN的免疫组化

1.4.1 POSTN的免疫组化 PBS冲洗，乙二胺四乙酸（Ethylene DiamineTetraacetic Acid，EDTA）抗原修复，滴加3%过氧化氢阻断内源性过氧化物酶，滴加一抗（Periostin，1:250，Abcam，ab92460），4℃孵育过夜，加二抗（中杉金桥，sp-9000）后光镜控制下二氨基联苯胺（3,3’-diaminobenzidine，DAB）显色30～60s，苏木素复染，封片。PBS缓冲液代替一抗作为阴性对照。判定标准[7]：以肿瘤间质呈棕色或棕褐色为阳性，＜5%间质阳性为阴性或者弱表达（-/+），5%～50%间质成分表达为中度表达（++），＞50%间质成分表达为强表达（+++）。

1.4.2 颅咽管瘤细胞与成纤维细胞的鉴定 使用细胞免疫组化鉴定培养细胞。4%多聚甲醛固定细胞爬片，改用一抗为广谱角蛋白（pan Cytokeratin）（1:100，北京博奥森）抗体，其余免疫组化方法同上。

1.5 肿瘤和下丘脑关系评价术后，根据手术记录及复习术中录像进行肿瘤和下丘脑关系评价，术者漆松涛的判定标准为：轻度粘连为肿瘤与第三脑室底容易分离，术后第三脑室底膜及神经组织层完整保留；高度粘连为肿瘤与第三脑室底广泛粘连，移行部位难以界定，手术过程多只能锐性分离，第三脑室底菲薄、部分缺损，术中难以鉴别，肿瘤组织剥除过程中易碎；中度粘连为介于以上粘连范围之间者[8]。

1.6 术后下丘脑状态评分(Hypothalamic Status Scale，HSS)参照Fahlbusch等[9]报道：I级为术后没有出现新的持续性的神经系统症状、神经心理症状和内分泌改变；II级为术后出现新的内分泌症状，需要持续性替代治疗；III级为术后出现新神经系统症状或神经心理症状，但患者尚能自理；IV级为术后出现严重神经系统症状或神经心理症状，患者不能自理或者术后死亡。

1.7 下丘脑肥胖判断根据术后体质指数（Body Mass Index，BMI），儿童患者体质量超重为BMI≥同龄儿童1个标准差，肥胖为BMI≥同龄儿童2个标准差；成人患者24kg/m2≤BMI＜28 kg/m2为超重，≥28 kg/m2为肥胖[10]。

1.8 随访术后3个月复查头颅MRI，其后术后2年内每半年复查一次头颅MRI，2年后每1年复查头颅MRI。复查MRI时，同时行激素水平测试、眼科检查、HSS评分、生长发育检查和BMI检查。

1.9 统计学分析采用SPSS 13.0对数据进行处理，骨膜蛋白表达量与复发关系分析Mann-Whitney检验，骨膜蛋白表达量与BMI、HSS评分和下丘脑粘连相关性分析采用Spearman非参数检验。检测水准α=0.05。

2 结果

2.1 临床情况42例患者，术中判断为轻度粘连13例，中度粘连18例，重度粘连11例（图1）；随访20～112个月，平均（57.8±26.9）个月。随访期内，无死亡病例。5例患者出现复发。15例患者随访期内体质量正常，17例超重，10例肥胖。11例患者术后HSS评分I级，13例HSS评分II级，12例HSS评分III级，6例HSS评分IV级。

2.2 颅咽管瘤细胞与成纤维细胞鉴定多篇文献报道[11-13]颅咽管瘤细胞可通过细胞免疫组化鉴定并与成纤维细胞相鉴别。其中颅咽管瘤细胞表达pan-CK，而成纤维细胞不表达pan-CK，本实验结果与文献所述一致（图2）。

2.3 POSTN在颅咽管瘤肿瘤组织中表达情况POSTN在颅咽管瘤肿瘤组织中表达于间质成分（图3）。其中13例为阴性或者弱表达（-/+），16例间质成分表达为中度表达（++），13间质成分表达为强表达（+++）。POSTN表达和肿瘤术后复发无统计学差异（Mann-Whitney检验，Z=-0.236，P=0.813），POSTN表达和术中肿瘤和三脑室底粘连程度呈正相关（Spearman秩相关检验，r=0.685，P＜0.001）；POSTN表达和术后HSS评分呈正相关，表达越强，术后HSS评分越高（Spearman秩相关检验，r= 0.569，P＜0.001）；POSTN表达和术后下丘脑肥胖成正相关性，表达越强，术后BMI指数越大（Spearman秩相关检验，r=0.594，P＜0.001）（表1）。

3 讨论

图1 前纵裂经终板入路三脑室底内型颅咽管瘤患者术中所见。A图示肿瘤和三脑室底周围组织结构轻度粘连，三脑室底光滑（黑色箭头）；B图示肿瘤和三脑室底周围组织结构重度粘连（黑色箭头）

图2 颅咽管瘤与成纤维细胞的鉴定以及POSTN在两种细胞的表达。A：图示成釉上皮型颅咽管瘤细胞pan-CK阳性表达；B：图示成纤维细胞pan-CK阴性表达

图3 POSTN在颅咽管瘤组织表达模式。A图示POSTN在颅咽管瘤组织的间质中高表达；B图示POSTN在颅咽管瘤组织中无表达；C图示POSTN在成釉上皮型颅咽管瘤的原代细胞中不表达；D图示POSTN在从颅咽管瘤原代细胞中培养分离出的成纤维细胞（间质成分）中高表达

颅咽管瘤是鞍区最常见肿瘤之一，尽管WHO中枢神经系统病理分类将其归为WHO I级肿瘤，但是由于其起源和毗邻位置，手术时投鼠忌器，导致该肿瘤术后极易复发。因此有良性肿瘤，恶性生物学行为的说法[14]。

根据多年的经验，我们将颅咽管瘤外科分型分为Q型（鞍膈下型），S型（鞍上脑室外型）和T型（三脑室底内型）[6]。其中T型肿瘤，是所有颅咽管瘤手术切除难度最大的一型，也是术后并发症、术后反应及复发率较高的一型。主要是因为该型肿瘤和下丘脑关系密切，手术时为了全切肿瘤，往往不得已牺牲部分三脑室底的正常组织[8]。通过我们观察，部分该型肿瘤和三脑室底关系粘连十分紧密，移行部位难以界定，手术过程多只能锐性分离，导致第三脑室底组织不能保留；而部分患者尽管影像学上同为T型肿瘤，但是肿瘤和三脑室底轻微粘连，甚至无粘连，手术分离容易，术后三脑室底能够完好保留。导致上述两种现象的原因尚不得知。

POSTN是一种细胞外基质蛋白。已经证实该蛋白在多种恶性肿瘤间质广泛表达，且与恶性肿瘤的侵袭、转移、分期等密切相关。POSTN高表达者，肿瘤往往容易侵袭、转移，分期较高[15，16]。目前主要认为POSTN介导的上皮-间质转换（Epithelial-Mesenchymal Transition，EMT）是导致这些效应的机制之一[17]。我们前期研究结果显示，EMT存在于在成釉上皮型颅咽管瘤中，在颅咽管瘤前沿细胞中，EMT尤为明显[18]。

通过上述实验，我们发现，POSTN表达与术中肿瘤和三脑室底粘连的程度成正相关，考虑其可能介导了颅咽管瘤的EMT现象，增强了肿瘤对于三脑室底的粘连甚至向三脑室底组织内的入侵。除此之外，POSTN的表达还与术后下丘脑评分、BMI指数也呈正相关。表明POSTN可以作为一个反应成釉细胞型颅咽管瘤术后下丘脑功能的一个指标。然而，POSTN的表达，和术后复发之间没有统计学意义，这表明下丘脑和三脑室底粘连程度在以激进全切除的颅咽管瘤手术理念中，不是一个影响术后复发的因素。部分颅咽管瘤患者在激进全切除后，出现复发的原因，被认为是激进全切除仅仅在肉眼或手术显微镜下对肿瘤进行了全切除，但是在“细胞学”水平，可能还残留了部分肉眼不可见的肿瘤细胞，导致了术后的复发。因此，POSTN低表达的三脑室底型颅咽管瘤患者往往会提示较好的预后。而对于POSTN高表达的三脑室底型颅咽管瘤患者，尽管统计学分析其高表达在激进全切除下和低表达的患者复发没有统计学意义，但仍然需要加强术后随访，及早对下丘脑功能状态，如认知功能下降，肥胖等进行早期干预和预防，使得术后对下丘脑功能的影响降至最低程度，改善患者的生活质量和功能预后。

表1 POSTN表达和颅咽管瘤术中术后变量相关性分析

POSTN表达情况局限于手术标本获取后的免疫组化检查，而其在肿瘤中的表达量无法在术前得知。因此，POSTN的高表达只对加强随访和早期干预下丘脑并发症有重要意义，而无法对术前治疗方式和治疗理念的选择提供帮助。探寻外周血中POSTN的表达与免疫组化表达之间的相关性将是下一步研究的重点。

目前，颅咽管瘤的治疗理念存在较大争议，部分学者偏向于激进全切除，以减少术后复发；部分学者则偏向于次全切除同时行术后放疗，对于囊性病变，部分中心采用囊液抽取后囊内内照射的方法，均取得了一定效果。对于大宗病例长期随访后显示，激进全切除病例术后复发率最低。然而，不能否认的是，对于T型颅咽管瘤，尤其是囊壁和三脑室低粘连严重的患者，全切除后可能出现较为严重的并发症。但是只要在良好的术后护理及支持治疗下，患者仍然能够长期生存，且大部分患者能够拥有相对满意的生存质量。

总之，T型颅咽管瘤和三脑室底的粘连程度可能是决定该肿瘤预后的重要因素。POSTN的表达能够反应肿瘤和三脑室底的粘连程度，并作为一个预测肿瘤全切后下丘脑功能的指标。下丘脑和三脑室底粘连程度在以激进全切除的颅咽管瘤手术理念中，不是一个影响术后复发的因素，在颅咽管瘤手术治疗中，尤其是初发患者，应该追求最大程度的全切除，以减少术后肿瘤复发。

[1] Litvin J,SelimAH,Montgomery MO,et al.Expression and function of periostin-isoforms in bone[J].JCell Biochem,2004,92(5): 1044-1061.

[2] Kudo A.Periostin in fibrillogenesis for tissue regeneration:periostin actions inside and outside the cell[J].Cell Mol Life Sci, 2011,68(19):3201-3207.

[3] Horiuchi K,Amizuka N,Takeshita S,et al.Identification and characterization of a novel protein,periostin,with restricted expression to periosteumand periodontal ligament and increased expression by transforming growth factor beta[J].JBone Miner Res,1999,14(7):1239-1249.

[4] Romanos GE,Asnani KP,Hingorani D,et al.PERIOSTIN:role in formation and maintenance of dental tissues[J].JCell Physiol, 2014,229(1):1-5.

[5] Ruan K,Bao S,Ouyang G.Themultifaceted role of periostin in tumorigenesis[J].CellMol Life Sci,2009,66(14):2219-2230.

[6] Qi S,Lu Y,Pan J,et al.Anatomic relations of the arachnoidea around the pituitary stalk:relevance for surgical removal of craniopharyngiomas[J].Acta Neurochir(Wien),2011,153(4): 785-796.

[7] Gunia S,Jain A,Koch S,et al.Periostin expression correlates with pT-stage,grading and tumour size,and independently predicts cancer-specific survival in surgically treated penile squamous cell carcinomas[J].Clin Pathol,2013,66(5):297-301.

[8] 周杰，漆松涛，潘军，等.颅咽管瘤组织炎性反应与临床病理和肿瘤预后相关性分析[J].中华神经外科杂志,2013,29 (005):461-464.

[9] Fahlbusch R,Honegger J,PaulusW,etal.Surgical treatmentof craniopharyngiomas:experience with 168 patients[J].Journal of neurosurgery,1999,90(2):237-250.

[10] Zhou BF.Predictive values of body mass index and waist circumference for risk factors of certain related diseases in Chinese adults--study on optimal cut-off points of body mass index and waist circumference in Chinese adults[J].Biomed Environ Sci,2002,15(1):83-96.

[11] Li Q,You C,Zhou L,et al.All-trans retinoic acid inhibits craniopharyngioma cell growth:study on an explant cellmodel[J]. Journal of neuro-oncology,2013,112(3):355-364.

[12] 徐建国，刘亮，饶正西，等.颅咽管瘤细胞系的初步建立[J].四川大学学报:医学版,2011,42(3):417-421.

[13] 周杰，漆松涛，潘军，等.造釉细胞型颅咽管瘤细胞体外培养与检测[J].中华神经外科杂志,2012,28(004):368-371.

[14] 漆松涛，潘军，黄胜平，等.大型颅咽管瘤生长方向及侵袭特征与手术效果探讨[J].中国神经精神疾病杂志,2002，28（4):268-272.

[15] 孙其恺，吕阳，王伟.periostin与肿瘤相关研究进展[J].中华外科杂志,2013,51(7):659.

[16] Sasaki H,Sato Y,Kondo S,et al.Expression of the periostin mRNA level in neuroblastoma[J].J Pediatr Surg,2002,37(9): 1293-1297.

[17] Morra L,Moch H.Periostin expression and epithelial-mesenchymal transition in cancer:a reviewand an update[J].Virchows Arch,2011,459(5):465-475.

[18] Qi ST,Zhou J,Pan J,et al.Epithelial-mesenchymal transition and clinicopathological correlation in craniopharyngioma[J].Histopathology,2012,61(4):711-725.

Expression of Periostin in Craniopharyngioma Involving Third Ventricular Floor and its Relationship to Hypothalamus Functions.

CHEN Ming,LIU Yi,CAO Yongfu,PAN Jun,SHI Jin,WANG Chaohu,WAN Renkuan,FENG Zhanpeng,YIN Chunmei,QI Songtao.
Department of Neurosurgery,Nanfang Hospital of Southern Medical University, Guangzhou 510515,China.Tel:86-020-61641806.

ObjectiveTo evaluate the expression and clinicalsignificance of Periostin(POSTN)in craniopharyngioma.MethodsForty-two patients with pathologically diagnosed adamantinomatous craniopharyngioma involving the floor of 3rd ventricle were retrospectively analyzed.The correlation between expression of POSTN and outcome was studied.ResultsPOSTN was expressed in stroma of craniopharyngioma tissues.The expression of POSTN was notassociated with the postoperative recurrence(Z=-0.236，P=0.813)while was associated with the degree of the adhesion between tumor and floor of 3rd ventricle(r=0.685,P＜0.001),postoperative Hypothalamic Status Scale(r=0.569,P＜0.001)and Body Mass Index(r=0.594,P＜0.001).ConclusionsPOSTNmay predict the degree of the adhesion between craniopharyngioma and 3rd ventricle floor.The high expression of POSTNmay indicate theworse hypothalamus function.

Craniopharyngioma Periostin Hypothalamus Prognosis

R739.41

A

2014-08-11）

（责任编辑:甘章平）

10.3936/j.issn.1002-0152.2014.11.008

☆ 广东省自然科学基金重点项目（编号：S2011010003063）；广东省自然科学基金自由申请项目（编号：S2011020005179）；国家临床重点专科建设项目经费资助

* 南方医科大学南方医院神经外科（广州510515）