UPLC-MS/MS检测降血脂类保健食品中违法添加物

郝刚 顾炳仁

（苏州市食品药品检验所，江苏苏州 215104）

UPLC-MS/MS检测降血脂类保健食品中违法添加物

郝刚 顾炳仁

（苏州市食品药品检验所，江苏苏州 215104）

目的：建立专属、灵敏的超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS）用于快速定性定量检测降血脂类保健食品中3种违法添加化学成分。方法：供试品经甲醇提取后，采用UPLC-MS/MS，以BEH-C18为分析柱，流动相采用含20 mmol/L乙酸铵的水溶液和甲醇进行等度洗脱，采用电喷雾电离、子离子扫描（Daughter Scan）及多重反应监测（MRM）模式对保健食品中违法添加的烟酸、辛伐他汀、洛伐他汀3种化学成分进行快速定性定量检测。结果：所建立方法可在1 min内快速定性定量检测保健食品中3种违法添加化学药物，且线性关系良好，平均加样回收率在95.4%～98.8%，方法检出限为0.5～12.5 μg/g。结论：该方法快速、灵敏、专属性强，适用于降血脂类保健食品中违法添加化学药物的快速定性定量检测。

超高效液相-串联质谱法；多重反应监测；降血脂类保健食品；违法添加物

WORDSUPLC-MS/MS；MRM；Lipid Lowering Health Foods；Illegal Additives

近年来，伴随高血脂发病率的逐年上升，降血脂类中成药和保健食品等健康产品的市场销量不断上升[1]。一些不法企业为牟取暴利，在产品中添加具有降血脂功效的化学治疗药物，不仅严重影响了降血脂类健康产品的行业发展，也给广大人民的饮食用药安全带了严重危害[2]。原国家食品药品监督管理局于2010年颁布了烟酸、辛伐他汀、洛伐他汀等3种辅助降血脂类保健食品违法添加药物的检测方法，但该方法检测时间长（进样时间为36 min），且灵敏度低[3]。本实验基于超高效液相色谱-串联质谱法（UPLC-MS/MS），采用多重反应监测（MRM）模式，建立了同时定性、定量检测降烟酸、辛伐他汀、洛伐他等违法添加药物的分析方法，为降血脂类保健食品的安全监控提供可靠的技术保障。

1 材料与方法

1.1 仪器

ACQUITY UPLC Xevo TQ-S三重四级杆液质联用仪（美国Waters公司）；电喷雾离子源（ESI），Masslynx 4.1数据处理系统（Waters）；Thermo低温离心机；KQ-300DA型数控型超声波清洗器；MILLIPORE纯水仪。

1.2 样品与试剂

烟酸对照品（批号：201102，含量99.9%）、辛伐他汀对照品（批号：100601-201003，含量99.0%）、洛伐他汀对照品（批号：100600-201003，含量99.4%）均购于中国食品药品检定研究院；实验用水为超纯水，其他试剂均为色谱纯。实验所用样品均为当地食品药品监督管理局抽样样品。

1.3 色谱条件

色谱柱：BEH-C18色谱柱（2.1 mm×50 mm，1.7 μm）；流动相：A（含20 mmol/L乙酸铵的水溶液）：B（甲醇）=20:80（v/v），流速0.3 mL/min。色谱柱温度：25℃；进样盘温度：4℃；进样量：1 μL。

（7）Marriage,Divorce and Quasi-rents:Or,I Gave Him the Best Years of My Life(结婚、离婚与准用；或“青春年华付与君”)

1.4 质谱条件

ESI；正离子扫描；毛细管电压4.0 kV；脱溶剂气温度：350℃；脱溶剂气体流量：800 L/h；锥孔气流量：150 L/h；碰撞气体为氩气；子离子扫描及MRM模式同时监测。

1.5 对照品溶液

分别精密称取烟酸约50 mg，辛伐他汀、洛伐他汀约10 mg，置10 mL量瓶中，加甲醇溶解并稀释至刻度，摇匀，分别精密量取1 mL置10 mL量瓶中，加甲醇稀释至刻度，混匀，作为烟酸（500 μg/mL）、辛伐他汀（100 μg/mL）、洛伐他汀（100 μg/mL）对照品储备液。将上述3种对照品储备液各量取10 mL，置100 mL量瓶中，加甲醇至刻度，混匀，作为混合对照品储备液。

1.6 样品制备

样品研细后，精密称取细粉1.0 g置于50 mL量瓶中，加甲醇约20 mL，超声15 min，放冷至室温，加甲醇至刻度，摇匀，滤过，取续滤液，13 000 r/m离心10 min，取上清液稀释500倍，13 000 r/m离心10 min，0.22 μm滤膜过滤，取上清液1 μL进样分析。

2 实验结果

2.1 质谱条件优化

分别将3种对照品储备液用甲醇稀释成500 ng/mL的对照溶液，选用ESI（＋）离子化模式，通过直接进样法，进行质谱条件优化。首先，采用一级质谱扫描方式得到各化合物准分子离子峰，在确定准分子离子的基础上，进行锥孔电压的优化，得到各化合物的最佳锥孔电压。再通过子离子扫描模式，对各种化合物的分子离子进行二级碎片离子扫描，每种化合物选择2个特征碎片离子作为检测离子，用于化合物定性判断的依据，实验结果如图1所示。各化合物的分子离子及特征碎片离子分别为：烟酸（m/z）：124＞106，80；辛伐他汀（m/z）：419＞285,199；洛伐他汀（m/z）：405＞285，199。

实验中同时确定各化合物的最佳碰撞能量，并采用MRM扫描模式对各化合物的检测离子进行扫描，其中响应较高的离子对作为定量离子对。各化合物质谱条件优化结果如表1所示。

2.2 方法专属性

精密量取烟酸、辛伐他汀、洛伐他汀对照品储备液各1 mL至100 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容，作为混合对照品溶液，取1 μL进样分析，MRM离子流色谱图如图2（A）所示，烟酸、洛伐他汀、辛伐他汀保留时间分别为0.44，0.81，0.89 min。

取空白样品（经检测不含违法添加成分的降血脂类保健食品），按“1.6样品制备”方法处理后进样分析，实验结果如图2（B）所示，空白生物样品MRM离子流色谱图在0～2 min内无干扰。

图1 子离子质谱

表1 MRM分析的质谱条件

取空白样品溶液，加入1 mL混合对照品溶液，再按“1.6样品制备”方法处理后进样分析，MRM离子流色谱图如图2（C）所示，空白样品对3种化合物的保留时间无影响，所建方法专属性良好。

2.3 线性范围

精密量取烟酸、辛伐他汀、洛伐他汀对照品储备液各1 mL至50 mL量瓶中，加甲醇稀释并定容，作为混合对照品溶液，再用甲醇逐级稀释成不同浓度的混合对照品系列溶液。其中，烟酸浓度为：1 000，500，200，100，50，10，5 ng/mL；辛伐他汀与洛伐他汀的浓度为：200，100，40，20，10，2，1 ng/mL，取系列溶液中不同浓度混合对照品溶液1 μL进样分析，以峰面积为纵坐标（Y），各对照品浓度为横坐标（X）进行回归，结果如表2所示，烟酸在5.0～1 000.0 ng/mL浓度范围内线性良好，辛伐他汀与洛伐他汀在1.0～200.0 ng/mL浓度范围内线性良好。

图2 MRM离子流色谱

表2 线性范围实验结果

2.4 检出限

分别取3种化合物的对照品储备液，用甲醇逐级稀释到一定浓度，以信噪比（S/N）大于3为仪器检出限，结果如图3所示，烟酸、辛伐他汀、洛伐他汀的仪器检出限分别为：0.5，0.05和0.02 ng/mL。

根据仪器检出限及“1.6样品制备”项的稀释倍数，空白样品中加入对照品溶液，经处理后进样分析，以S/N等于3，测得方法检出限分别为：烟酸12.5 μg/g，洛伐他汀1.25 μg/g，辛伐他汀0.5 μg/g。

图3 烟酸(A)、洛伐他汀(B)、辛伐他汀(C)的检出限

2.5 精密度试验

取2.3项下的混合对照品溶液（烟酸：50 ng/mL；辛伐他汀、洛伐他汀：10 ng/mL），连续进样6次，计算3种化合物峰面积的RSD分别为：烟酸：1.91%；辛伐他汀：1.23%；洛伐他汀：1.70%，结果表明仪器精密度良好。

2.6 加样回收率

分别精密吸取混合对照品储备液8，10，12 mL各3份，共9份，分别置于50 mL量瓶中，每个量瓶精密加入经测定不含违法添加药物的保健品试样处理液20 mL，按“1.6样品制备”方法处理后进样分析，将结果代入回归方程，计算回收率，3种化学成分的平均加样回收率分别为：烟酸96.9%，辛伐他汀98.8%，洛伐他汀95.4%。

2.7 样品测定结果

按1.6项下对20批降血脂类保健食品进行样品前处理，以所建液质联用方法对样品进行定性、定量分析，其中2批供试品的子离子扫描图与烟酸对照品的特征离子对（m/z 124→106和m/z 124→80）一致，通过MRM质谱图计算烟酸含量分别为89.2 μg/g和125.4 μg/g，其余批次样品均未检出烟酸、辛伐他汀和洛伐他汀。此外，运用国家食品药品监督管理总局颁布的标准方法对上述批次样品检测[3]，其阳性检出结果与本方法一致。

3 讨论

高血脂症作为一种高发的现代病，可引发动脉粥样硬化、冠心病、胰腺炎等一些严重危害人体健康的疾病。除了降血脂药物，以调节血脂为功效的保健食品的国内市场销量不断上升。然而，一些生产商受利益驱动，在该类保健品中人为掺杂化学药物，严重威胁了服用者的生命健康[4-5]。如长期过量服用烟酸可导致心律失常、肝功能损伤[6]；而他汀类药物除一般的消化系统反应外，还能诱发横纹肌溶解症，重者可导致急性肾衰[7-8]。由于这些违禁药物具有添加量少，隐蔽性强等特点，开发灵敏度高、专属性强的快速定性、定量分析方法已成为当务之急。

本实验针对国家食品药品监督管理总局规定的烟酸、辛伐他汀、洛伐他汀等3种辅助降血脂类保健品违法添加药物，基于UPLC的超高分辨能力、超高分析速度，及MS/MS提供的结构信息，开发了同时定性、定量检测上述3种非法添加药物的分析方法。通过子离子扫描和MRM扫描模式，针对每个化合物选取两个特征碎片离子作为定性依据，同时选择其中响应较高的反应离子对作为定量离子对，从而实现定性定量同时分析。并将该方法应用于20批降血脂类保健品非法添加的检测，检验结果与国家食品药品监督管理总局颁布的标准方法一致，但本方法大大缩短了分析所需时间，并同时计算出违法添加药物的含量，改进了现行的标准检验方法，提高了降血脂类保健食品非法添加的检验效率，为该类保健食品的安全监控提供了可靠的技术保障。

[1]白鸿.保健食品功效成分检测方法[M].北京：中国中医药出版社，2011：66.

[2]谢志洁.健康产品中非法添加化学成分快速筛查方法理论与实践[M].广东：华南理工大学出版社，2011：10-16.

[3]国家食品药品监督管理局.辅助降血脂类保健食品违法添加药物的检测方法[S].国食药监办许[2010]114号.2010-04-27.

[4]李丹，文红梅，崔福春，等.LC-MS/MS法快速测定中成药、保健食品中非法添加的36种化学成分[J].药物分析杂志，2010，30（8）：135-140.

[5]陈海滨，吴春敏，胡敏，等.LC-MS/MS检测降压类中药制剂中非法添加的9种化学药物[J].海峡药学，2012，24（9）：51-54.

[6]Kirkland JB.Niacin requirements for genomic stability[J].Mutat Res，2012，733（1-2）：14-20.

[7]Toth PP.An update on the benefits and risks of rosuvastatin therapy[J].Postqrad Med，2014，126（2）：7-17.

[8]Robinson M，Gunning K，Pippitt K，et al.Team-based approach to addressing simvastatin safety concerns[J].J Am Pharm Assoc，2013，53（5）：539-544.

Rapid Identification of Illegal Additives in Lipid Lowering Health Foods by UPLC-MS/MS

Hao Gang，Gu Bingren（Suzhou Institute for Food and Drug Control，Jiangsu Suzhou 215104，China）

Objective：To develop a specific and sensitive method by UPLC-MS/MS for the qualitative and quantitative detection of 3 illegal additives in lipid lowering health foods.Methods：UPLC-MS/MS was adopted to test the samples extracted with methanol.BEH-C18was used as the analytical column with 20 mmol/L ammonium acetate aqueous solution and methanol as the mobile phase for isocratic elution.The qualitative and quantitative detections of 3 chemical components including nicotinic acid，simvastatin and lovastatin were conducted UPLC-MS/MS in the mode of electrospray ionization (ESI)，the daughter ion scan and multiple reaction monitoring（MRM）.Results：The established method can identify within 1 min the 3 illegal additives in health foods qualitatively and quantitatively.The calibration curves showed a good linear relationship for each component.The determination limit was at 0.5～12.5 μg/g，and the average recovery rate was 95.4%～98.8%.Conclusion：The method was proved to be specific，rapid and sensitive，which can be used to identify 3 illegal additives in lipid lowering health foods.

10.3969/j.issn.1672-5433.2014.07.005

2014-06-27）

苏州市科技发展计划项目科技支撑计划（SS201220）

郝刚，男，博士，主管药师。研究方向：食品药品质量安全监控。E-mail:haogang531@163.com

顾炳仁，男，主任药师。研究方向：食品药品质量安全监控。通讯作者E-mail:gubingren@163.com