基于核酸适体和纳米材料构建电化学生物传感器用于多巴胺的检测

廖妮,邹雪

（攀枝花学院生物与化学工程学院,四川攀枝花 617000）

基于核酸适体和纳米材料构建电化学生物传感器用于多巴胺的检测

廖妮*,邹雪

（攀枝花学院生物与化学工程学院,四川攀枝花 617000）

该文探究了一种基于核酸适体和纳米金包四氧化三铁(Au@Fe3O4)纳米粒子所构建的新型电化学生物传感器用于多巴胺(DA)的检测。首先，在玻碳电极(GCE)表面电沉积一层纳米金(nano-Au)用于多巴胺适体(DBA)的固定。然后HT做为封闭剂以减少非特异性吸附。接着通过与DBA的特异性结合将DA固载于电极表面。在EDC/NHS作用下，生物素(Bio)的羧基与DA的氨基结合，最后通过生物素与亲和素特异性识别作用将含有电化学活性物质硫堇的纳米复合材料固定于电极表面，制得夹心型的适体传感器。在最优条件下，该传感器对0.001 nmol/L～100 nmol/L DA的检测具有良好的电流响应，检出限0.33 pmol/L(S/N=3)。该适体传感器具有操作简单、操作简便、选择性好、灵敏度高、检测范围广、检出限低的优点。

电化学适体传感器；多巴胺；金包四氧化三铁；硫堇；生物素-亲和素系统

0 引言

电化学生物传感器发展至今[1]，提高其灵敏度和增强电极的响应信号仍然是电化学传感器研究探讨的一项关键内容。纳米技术的出现为纳米材料在生物大分子的组装及生物传感器[2～4]领域的应用开辟了新的思路。纳米材料[5～7]由于具有比表面积大、表面自由能高以及优良的生物相容性等这些独特的物理和化学性质，使其在纳米科学领域受到广泛的重视，同时也推动了化学和生物传感器的迅速发展。在生物传感器的构建及提高检测的灵敏度方面，纳米材料都显示出卓越的优势。在纳米修饰电极中，组装的纳米材料具有大的表面积，可以固载成百上千的信号分子，因而可以对检测信号起到扩增的作用。而细小的纳米粒子可渗透到生物大分子内部接触到生物大分子的电活性中心，从而缩短生物大分子活性中心与电极表面的距离，加快直接电子传递的速度。同时纳米粒子具有良好的生物兼容性，可以最大限度地保持蛋白质与酶等生物分子的活性。该文拟以核酸适体[8～11]特异识别生物分子、纳米材料提高生物组分的固定及放大信号，设计一类高灵敏度的电化学适体传感器。在此基础上还应用到硫堇的双氨基特性以及在pH=7.0的PBS底液中的氧化还原峰。此外，还利用了生物素-亲和素系统结合牢固，多级放大效应。从而使现象更加明显，有利于对适体传感器的检测。

1 实验部分

1.1 仪器

CHI600D电化学工作站(上海辰华仪器公司)，超声波清洗仪DS-1510DT(上海生析超声器有限责任公司)，MP230酸度计(瑞士Metter Toledo公司)，AB204-S电子天平(瑞士Metter Toledo公司)。实验采用三电极体系，修饰过的玻碳电极(GCE，Φ=4 mm)为工作电极，铂电极为辅助电极，饱和甘汞电极(SCE)为参比电极。

1.2 试剂

多巴胺适体(碱基序列为5′-SH-(CH2)6GTC TCT GTG TGC GCC AGA GAA CAC TGG GGC AGA TAT GGG CCA GCA CAG AAT GAG GCC C-3′)（生工生物工程，上海）；亲和素(Avidin)（中国Bioss公司）；氯金酸(HAuCl4)，己硫醇(96%HT)，牛血清蛋白(BSA)，血红蛋白(Hb)，硫堇(Thi)，生物素(Bio)(Sigma公司，美国)；多巴胺(DA)，三羟甲基氨基甲烷-盐酸缓冲液(Tris-HCl)(Roche公司，瑞士)；磷酸缓冲溶液(PBS)，20 nmol/L Tris-HCl缓冲液(pH=7.4)用140 nmol/L NaCl+5 nmol/L KCl+1 nmol/L MgCl2制备。0.1 mol/L的磷酸缓冲液(pH= 7.4)用10 nmol/L Na2HPO4+10 nmol/L KH2PO4+2 nmol/L MgCl2制备，并用于整个实验过程。相关试剂均为分析纯，及时制备使用，实验用水均为二次蒸馏水。

1.3 适体传感器的制备

电化学适体传感器的制备过程见图1。首先分别用粒径为0.3 μm和0.05 μm的Al2O3粉末对玻碳电极进行打磨，然后在二次蒸馏水中超声清洗3次（3 min/次）。然后将打磨干净的电极在1%的HAuCl4溶液中在-0.2 V条件下进行沉积30 s，然后在电极表面滴加20 μL的DBA溶液（2.5 μmol/L）在常温下放置16 h，接着滴加20 μL的HT孵育1 h，以封闭非特异性吸附位点。然后在所修饰的电极表面滴加20 μL的DA孵育20 min（经对其孵育时间的优化确定），再加入20 μL的用EDC/NHS活化了羧基的生物素孵育30 min，最后加入20 μL的Au@Fe3O4/Thi/Avidin纳米复合材料孵育30 min后即可测定。

图1 适体传感器的制备过程示意图Fig.1The preparation of aptamer sensor process diagram

2 结果与讨论

2.1 适体传感器的分步表征

图2 不同修饰电极的循环伏安表征。(a)裸玻碳电极；(b)nano-Au修饰的电极；(c)固定了DBA的电极；(d)HT封闭的电极；(e)结合DA的电极；(f)加入Bio的电极Fig.2Cyclic voltammograms in[Fe(CN)6]4-/3-buffer solution for(a)bare GCE；(b)nano-Au/GCE；(c)DBA/ nano-Au/GCE；(d)HT/DBA/nano-Au/GCE；(e)DA/HT/ DBA/nano-Au/GCE；(f)Bio/DA/HT/DBA/nano-Au/GCE

为保证电极进行修饰时的修饰效果，分不同的步骤依次对电极进行表征，测定不同步骤下电极的循环伏安行为。图2为电极在5 mmol/L铁氰化钾（[Fe(CN)6]4-/3-）中的分步表征图。曲线a为裸电极的循环伏安图；曲线b表示沉积纳米金后电极的循环伏安图，此时由于纳米金粒子对电子传输的促进作用，得到增大的峰电流值；曲线c表示孵育了DBA后电极的循环伏安图，因为适体的存在阻碍了电子的传输，使峰电流减小；曲线d表示加入HT后电极的循环伏安图，由于HT封闭了电极上的非特异性吸附位点，因此峰电流继续减小；曲线e表示加入10 nmol/L DA后电极的循环伏安图，因为DA与DBA发生特异性结合将膜表面的微孔通道堵塞，阻碍了电子的传递，峰电流继续减小。曲线f表示结合了生物后电极的循环伏安图，DA与生物素在EDC/NHS作用下交联缩合进一步阻碍电子的传递，从而进一步降低了响应电流。由对电极修饰的逐步表征可知，该适体传感器是成功制备了的。

2.2 孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin纳米复合材料前后的电极表征

图3为电极孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin纳米复合材料前后在PBS（pH=7.0）中的表征图。曲线a为加入Au@Fe3O4/Thi/Avidin纳米复合材料前电极的循环伏安图，此时在PBS中没有出峰；曲线b为加入Au@Fe3O4/Thi/Avidin纳米复合材料后电极的循环伏安图，图中可以明显看到一对硫堇的氧化还原峰，说明此复合物被成功固载到了电极表面。

图3 孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin纳米复合材料前后的电极表征(a)加入Au@Fe3O4/Thi/Avidin之前的电极表征；(b)加入孵育Au@Fe3O4/Thi/Avidin纳米复合材料之后的电极表征之后的电极Fig.3The aptasensors in the absence(a)and in the presence(b)of Au@Fe3O4/Thi/Avidin in 2 mL 0.1 mol/L PBS

2.3 多巴胺修饰时间的优化

由于DBA与DA结合程度与其反应时间相关，因此需实验探究其最佳结合时间。该试验研究了制备的传感器加入20 μL 10 nmol/L DA分别孵育5、10、15、20、25 min，用循环伏安法测定其响应电流的变化。图4-A为不同孵育时间电极在[Fe(CN)6]4-/3-中的循环伏安图；图4-B为不同孵育时间电极的响应电流差值的线性关系图。如图所示，峰电流值随着孵育时间的增加而降低，到20 min往后基本变化不大。所以，实验过程中选择的最佳孵育时间为20 min。

2.4 适体传感器的选择性

在最佳实验条件下，在PBS溶液(pH=7.0)中检测以浓度为100 nmol/L的葡萄糖(glucose)，L-半胱氨酸(L-cys),尿酸(UA)，抗坏血酸(AA)以及蒸馏水(blank)孵育的电极的电流强度，并且与以10 nmol/L的DA孵育的电极的电流强度比较。结果如图5所示。经blank、glucose、L-cys、UA、AA孵育后的电极的电流强度远低于与DA作用后的电流强度，说明该适体传感器对DA的检测具有高度的选择性。

图4 孵育时间对电极性能的影响：图A不同孵育时间电极的循环伏安图；图B不同孵育时间的线形关系图Fig.4The effect of the different incubation time after the aptasensor incubated in 10 nmol/L DA solution in 5 mmol/L [Fe(CN)6]4-/3-solution(pH=7.0)at 100 mV/s．

图5 传感器的特异性测定Fig.5The selectivity of the aptasensor examined by being incubated in the following samples under the same experimental conditions：(a)0 nmol/L DA；(b)100 nmol/L glucose；(c)100 nmol/L L-cys；(d)100nmol/L UA；(e)100 nmol/L AA；(f)10 nmol/L DA

2.5 适体传感器的重现性

所构建的适体传感器的重现性：5支同一批次修饰电极孵育相同浓度的1 nmol/L的多巴胺，所有的修饰电极表现出了相近的电化学响应信号，其相对标准偏差(RSD)为5.49%，说明所构建的传感器具有可接受的重现性。

2.6 适体传感器的实际应用

为了评估所构建的适体传感器在临床诊断的可行性，用标准添加的方法做了回收率实验，即用稀释的人体血清溶液配制了不同浓度的多巴胺溶液。检测结果显示回收率为94.9%～106%（如表1所示），在可接受的范围内，说明该生物传感器在临床诊断中具有一定的实际应用价值。

表1 传感器的加标回收试验Tab.1Determination of DA added in normal human serum with the proposed aptasensor

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A novel electrochemical aptasensor for sensitive detection of dopamine based on nucleic acid aptamer and nanomaterials

Liao Ni*,Zou Xue
(College of Biological and Chemical Engineering,Panzhihua University,Panzhihua 617000,China)

In this work,a novel strategy was constructed based on nucleic acid aptamer and nanomaterials for the sensitive detection of dopamine(DA).The thiolated dopamine binding aptamer(DBA)were firstly immobilized on the gold nanoparticles(nano-Au)modified glassy carbon electrodes(GCE).In the presence of target DA,the DBA could catch the DA onto the electrode surface.The anchored DA was then derivatized with biotin for the attachment of the conjugates which contain the electron media thionine to contrast a sandwich-type aptasensor.Under the optimal conditions,a wide detection range from 0.001 nmol/L to 100 nmol/L and a low detection limit of 0.33 pmol/L (defined as S/N=3)for DA were obtained.In addition,the sensor exhibited the advantages of simple operation,easy to operate,good selectivity,high sensitivity.

electrochemical aptasensor;dopamine;Au@Fe3O4;thionine;biotin-avidin system

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