海洋枝顶孢霉BH0531代谢物对松材线虫形态和酶活的影响

杜海霞，蒙春蕾，王勇勇，孟庆恒，2 *，孙建华，2

（1.天津师范大学 生命科学学院，天津 300387；2.天津市动植物抗性重点实验室，天津 300387）

全球每年因植物寄生线虫造成的损失达1 570亿美元[1]，我国每年有超过5 000万株松树死于松材线虫病，松材损失超过500万m3，年均发生面积近6万hm2，研究和开发高效的杀线虫制剂迫在眉睫[2]。真菌资源作为生物防治线虫的热点研究领域[3]，已从700多种杀线活性菌株中分离获得杀线活性物质230余种[4-5]。

枝顶孢霉属（Acremonium）是已知的具有杀线虫活性的种属之一，该属约有130余种，主要营腐生、植物寄生和自生，具有丰富的遗传和生态多样性[6-7]，特别是陆生性菌种有许多已被证实具有杀线虫活性[8]，如顶孢霉（A.coenophialum）能够降低短体线虫（Pratylenchus scribneri）和矮化线虫（Tylenchorhynchus acutus）虫口密度[9]；枝顶孢霉（A.stricturn）能够破坏甜菜胞囊线虫（Heterodera schachtii）的卵[10]，抑制大豆胞囊线虫（H.glycines）和南方根结线虫（Meloidogyne incognita）卵的孵化[11]。海洋来源的枝顶孢霉（Acremoniumsp.BH0531）也被证实具有明显的杀线虫作用，其代谢物具有分子质量小、水溶性好和耐热的特性[12]。在此基础上，从线虫的相关酶学变化和表观效应的角度对BH0531代谢物的杀线虫效应进行了进一步研究，探讨该菌对松材线虫的可能作用机理。

乙酰胆碱酯酶（acetylcholin esterase，AChE)存在于大部分脊椎动物、昆虫和线虫神经元内，特别是胆碱能神经元、神经肌肉接头处和肌肉组织中，能通过将类胆碱神经系统中神经递质乙酰胆碱催化水解为乙酸和胆碱来终止神经递质对突触后膜的兴奋作用，保证神经信号在生物体内正常传递，是生物神经传导中的一种关键性酶，常被作为神经毒剂检测的生化标志物，在毒理学研究上十分重要。而ATP酶通过水解ATP为生物体的一切生命活动提供能量，机体在缺氧及一些疾病状态下，此酶活力会发生一系列改变。因此，本研究对松材线虫体内与神经传导密切相关的AChE和与运动能量代谢有关的ATP酶比活力进行测定，对BH0531代谢物的杀线机理进行初步探究。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

海洋枝顶孢霉（Acremoniumsp.BH0531），菌种保藏号：CGMCC-5445、灰葡萄孢霉（Batrytis cinerea）：天津师范大学生命科学学院微生物实验室；松材线虫（Bursaphelenchus xylophilus）：中国农科院植保所研究院。

乙酰胆碱酯酶AChE测定试剂盒、总ATP酶测定试剂盒：南京建成生物工程研究所。

实验所用主要化学试剂均为国产分析纯。

1.2 仪器与设备

Leica DME光学显微镜：上海徕卡显微系统有限公司；UV-2550紫外可见分光光度仪：美国Varian公司；XTB-A5538体视显微镜：桂林光学仪器厂；SPX-250B-Z生化培养箱：上海博迅实业有限公司医疗设备厂；HZ-2010K控温摇瓶柜：上海欣蕊自动化设备有限公司。

1.3 实验方法

1.3.1 BH0531的培养

活化培养基：去皮马铃薯200 g煮汁，葡萄糖20 g，琼脂15 g，蒸馏水1 000 mL，接种后于26 ℃恒温箱内培养7 d。

发酵培养基：去皮马铃薯150 g煮汁，葡萄糖10 g，酵母膏1 g，海水600 mL，加蒸馏水定容至1 000 mL。

1.3.2 灰葡萄孢霉菌的培养10 g大麦仁，8 mL去离子水，大试管浸泡3 h，灭菌，接入灰葡萄孢霉，21 ℃下避光培养7 d。

1.3.3 供试线虫的培养与收集

在长满了灰葡萄孢霉的大试管内接入大小为1 cm2的松材线虫块，25 ℃下避光培养12 d。用贝尔曼漏斗法收集松材线虫，配制成15 000条/mL的悬液。

1.3.4 发酵液的制备

取新鲜培养的BH0531菌株斜面，加入无菌水洗脱孢子，制备成约1×106个/mL的孢子悬液，以2 mL接种量接入装有100 mL液体发酵培养基的500 mL三角瓶中，26 ℃条件下，120 r/min振荡培养4 d。将培养好的发酵液经真空抽滤后，4 ℃下离心（3 000 r/min、20 min），用孔径为0.22 μm微孔滤膜过滤即为所需的发酵液部分。

1.3.5 粗酶液制备

将处理线虫用无菌水离心洗涤3次（2 000 r/min，3 min/次）后，取虫体置于预冷的灭菌匀浆器中，加入2 mL预冷生理盐水，冰浴下匀浆15 min，4 ℃离心（3 000 r/min、20 min）取上清即为粗酶液。

1.3.6 生物活性检测测定

镜检：以无菌水为对照，按照1 500 条/mL发酵液，分别处理松材线虫2 h、4 h、8 h、16 h、32 h，每个处理设置3个重复。采用Leica光学显微镜，将不同处理时间段的线虫取样观察拍照并摄像，每个时间段重复取样3次，记录视野范围内线虫的振幅和扭动次数并计算频率。

酶比活力测定：采用南京建成生物工程研究所生产的乙酰胆碱酯酶AChE测定试剂盒与总ATP酶测定试剂盒，结合用UV-2550紫外可见分光光度仪，分别测定线虫AChE酶与ATP酶的比活力，具体操作步骤参照剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 BH0531发酵原液对松材线虫形体的影响

线虫经BH0531发酵原液处理后的形态观察结果如图1所示。图1A为对照组观察到的活体线虫，线虫体态自然，呈S型，虫体内容物分布均匀，结构完整。经BH0531发酵原液处理16 h后，虫体体态严重扭曲、扭结，呈“&”型（图1B）或“ω”形（图1C），少部分虫体僵直萎缩。处理32 h后，线虫尾部弯曲成钩状（图1D），个别蜷缩呈“o”型（图1E），头部肿胀（图1F），最终成C形、新月形或直形死亡（图1G）。

图1 BH0531发酵原液对松材线虫形体的影响Fig.1 Effect of BH0531 fermentation broth on the morphology of B.xylophilus

2.2 BH0531发酵原液对松材线虫运动能力的影响

采用Leica光学显微镜对测试线虫摄像1 min，测定线虫每分钟内扭动的次数，结果如图2所示。由图2可知，BH0531代谢物处理线虫2 h时，运动频率高的线虫（≥40次/min）所占比例比对照增加了13.9%，表明经代谢物处理后，线虫运动加快，处于兴奋状态。处理8 h后，处理组线虫开始出现运动频率≤10次/min的线虫，表明线虫的运动受到抑制。16 h后，处理组中高频率的线虫全部消失，中频率线虫减少为对照组的61.5%。处理32 h后，处理组的低频率线虫为对照组低频率线虫数量的8.26倍。

图2 BH0531发酵原液对松材线虫运动能力的影响Fig.2 Effect of BH0531 fermentation broth on the athletic ability of B.xylophilus

2.3 BH0531发酵原液对线虫体内乙酰胆碱酯酶和总三磷酸腺苷（ATP）酶的影响

2.3.1 对线虫乙酰胆碱酯酶（AChE）比活力的影响

图3 BH0531发酵原液对松材线虫AChE比活力的影响Fig.3 Effect of BH0531 fermentation broth on AChE activity of B.xylophilus

由图3可知，松材线虫乙酰胆碱酯酶对BH0531代谢物非常敏感，处理4 h内，AChE比活力急剧下降，由0.417 U/mg降至0.089 U/mg，仅为对照组的36.1%。处理后期，处理组线虫AChE比活力始终低于对照组，差异显著（P＜0.05）。结果表明，BH0531代谢物对松材线虫AChE比活力有强抑制作用，致使线虫神经传导紊乱，过度兴奋，中毒死亡。

AChE在线虫的体壁肌细胞、咽肌细胞、肛门神经节和头部神经元等部位都有表达，与神经递质密切相关[13-14]。线虫依靠体壁纵向排列的背肌带和腹肌带的收缩而获得蠕行的动力，在线虫的腹神经索和背神经索存在神经—肌肉突触，需通过神经递质乙酰胆碱来调节肌肉活动[15]。BH0531代谢物对松材线虫AChE比活力有强抑制作用，使线虫神经传导受阻，无法终止兴奋，肌肉痉挛，这与线虫处理前期扭动频率提升症状相符合。

2.3.2 对线虫总ATP酶比活力的影响

图4 BH0531发酵原液对松材线虫ATP酶比活力的影响Fig.4 Effect of BH0531 fermentation broth on ATPase activity of B.xylophilus

由图4可知，处理组线虫三磷酸腺苷酶（adenosine triphos phatase，ATPase）在处理前期（2 h），酶比活力由0.447 U/mg升至0.501 U/mg，酶比活力升高了17%，随着处理时间的延续又急剧下降至0.180 U/mg，下降为对照的59.1%。结果表明，ATP酶在处理前期（2 h）活力升高是用于满足线虫中毒后的信息传递和能量转换等要求。随着线虫中毒时间延长，ATP酶比活力被抑制。

ATP酶存在于线虫组织细胞及细胞器的膜上，在物质运输、能量转换以及信息传递方面具有重要作用。BH0531代谢物处理线虫2 h，线虫ATP酶比活力显著升高，可能与线虫过度兴奋，呼吸与代谢加快有关。随后，ATP酶活力降低，推测线虫由于肌肉麻痹，扭动频率减小，各项机能减退，所需能量减少。

3 结论

研究了海洋来源的枝顶孢霉（Acremoniumsp.BH0531）代谢物对松材线虫形态变化、运动能力及重要酶类的影响，从线虫表观效应和酶学变化等不同角度探究该菌杀线虫作用的可能机理，为该菌进一步开发成为植物寄生线虫生防治剂奠定实验室基础。结果表明，BH0531代谢物的杀线虫机制与有机磷和氨基甲酸酯类杀虫剂的机制类似，AChE可能是BH0531代谢物杀线的靶标之一，而ATP酶的变化则可能是由中毒症状引发，并非BH0531代谢物的直接作用靶标。

酶活性测试表明，该菌代谢物对松材线虫体内的乙酰胆碱酯酶AChE具较强抑制作用，酶比活力由0.417 U/mg降至0.089 U/mg；ATP酶活力先升高后下降，处理2 h酶比活力由0.447 U/mg升至0.501 U/mg，随着时间的持续又急剧下降至0.180 U/mg左右。这两种酶活力的变化情况与线虫处理后运动频率变化的观察结果相一致。

根据BH0531杀线活性代谢物水溶性好、分子质量小、热稳定性好等特点，可推断BH0531代谢物主要杀线虫活性成分可能为含氮糖类或含氮糖类衍生物。由于BH0531代谢物成分尚未确定，杀线机理尚有待进一步深入研究。

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