DSC法检测抗冻蛋白的热滞活性的研究

田童童，巩子路，张 建*

（石河子大学食品学院，新疆 石河子 832003）

抗冻蛋白（antifreeze proteins，AFPs）又称热滞蛋白，具有防止生物有机体遭受冻害的特殊功能。据GRAETHER SP等[1]报道抗冻蛋白首次在极地环境中生活的鱼体中发现，随后经过科学家的研究，在植物体及微生物体内也发现不同种类的抗冻蛋白。抗冻蛋白具有非依数性可以降低溶液的凝固点，但是不影响其熔点，二者之间的差值被称为热滞活性（thermal hysteresis activity，THA）[2]。

抗冻蛋白的抗冻活性定义为热滞性，利用热滞活性系数可以表示其抗冻活性。熔点越高（低）冰点越低（高），即二者差异越明显，表示抗冻蛋白的活性越强[3]，所以通过THA可以评价一种抗冻蛋白的抗冻活性，亦可以确定是否存在抗冻蛋白。

抗冻蛋白的热滞活性的检测中，显微镜观察法是最早使用也是使用最广泛的一种方法，微量渗透压计法和差示扫描量热法（differential scanning calorimetry，DSC）是目前使用比较常见的方法[4]。因为DSC法对冰晶含量可以做到比较准确的控制，此外也可以测定其体系中的含量，所显示出的结果精确度和重复性比较高，可以客观的反应其抗冻活性。但是使用这种方法检测抗冻活性的不足之处是耗时长，所需仪器设备的精度要高。

因此近年来诸多研究者将DSC法作为测定蛋白质功能性质的主要方法。GUERRERO P等[5]对不同pH值条件下压缩处理大豆蛋白膜的热血性质和机械性质进行了研究。实验采用DSC法等技术来探讨pH值对理化性质的影响同时也研究了机械性质与pH值和储存时间的关系[5]。黄晓毅等[6]介绍了DSC在肌肉蛋白质热稳定性、压力稳定性、凝胶特性和持水性研究的应用进展并且对DSC在肉类研究中的应用进行了展望。

在本次实验中，以胡萝卜（Daucus carota，Dc）作为研究对象，使用DSC法测定胡萝卜抗冻蛋白的THA。为了建立一种可行且准确的测定胡萝卜抗冻蛋白的THA的方法，对样品浓度、升降温速率、冰晶含量等有可能影响其THA的主要因素作了考察并且对该测定方法的稳定性、重复性和精确度进行详细的讨论分析。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

胡萝卜（Daucus carota）：购买于石河子市友好超市；低分子量标准蛋白Marker：购于北京生物科技有限公司；丙烯酰胺（acrylic amide，Acr），三羟甲基氨基甲烷（Tris hydroxymethyl methyl aminomethane，Tris）、甲叉双丙烯酰胺（Bis-acrylamide，Bis）：购置于北京化学试剂公司；β-巯基乙醇、考马斯亮蓝R-250、十二烷基硫酸钠（sodium dodecyl sulfate，SDS）、四甲基乙二胺（N，N，N'，N'-tetramethylethylenediamine，TEMED）：美国Sigma进口分装；

1.2 仪器与设备

FA1004型电子天平：上海精科电子天平厂；Mini-protein III：美国Bio-Rad公司；铝制坩埚、HSG-IIC4恒温水浴锅：江苏省金坛市仪器制造有限公司；差热分析仪DSC-7：上海沃特世科技有限公司；PHS-3C精密酸度计、YXJ-2台式离心机：上海安亭科技仪器厂。

1.3 实验方法

1.3.1 DcAFP的纯化

参照MEYER K等[7]报道的方法对DcAFP进行纯化实验。

1.3.2 聚丙烯酰胺凝胶电泳实验

聚丙烯酰胺凝胶电泳参照LAEMMLI UK等[8]报道的方法进行实验。样品与样品缓冲液按照体积分数1∶1的比例混合，沸水浴5min，上样量10μL，分离胶和浓缩胶的质量分数分别为12.0%和5%。样品分别在80V和120V恒压的条件下在凝胶中迁移，浓缩胶中迁移30min后进入分离胶直到指示剂距离凝胶板边缘1cm左右处停止电泳，整个电泳实验大概为5h。从凝胶板取下电泳胶片，将其置于染色缸中于摇床上染色40min，染色结束后于脱色液中脱色24h期间更换染色液4～5次。样品分子质量的确定根据标准蛋白Marker的相对迁移率计算获得。

1.3.3 DSC法测定样品THA

分离纯化的抗冻蛋白样品溶解于0.01mol/L磷酸缓冲液（phosphatebuffer solution，PBS）缓冲液（KH2PO4-Na2HPO4，0.1%聚乙烯吡咯烷酮（poly vinyl pyrrolidone，PVP），pH 8.0中，将盛有10μg样品的铝制坩埚置于样品池的中央，等待仪器稳定后进行检测。按照降温（-25℃）、升温（25℃）、降温（-25℃）的程序进行测定，同时记录数据ΔAm（体系结晶热）和Tm（样品熔点）。

然后按一定的升温速率升温使得样品为固-液混合物，此时的温度称为保留温度，用Th表示，该温度条件下停留2min，再进行降温至-25℃，反复上述过程，于相同的保留温度（Th）条件下停留2min，记录不同保留温度下开始结晶的温度（T0）和结晶热（ΔAf）。

公式（1）和（2）分别用来计算样品中的冰晶含量（Ф）和THA。

式中：Φ为样品中冰晶含量质量分数，%；ΔAf为保留温度停留后继续降温过程中体系的放热焓，即冰晶从液相转变为固相的过程中熔融物或溶液结晶时所放出的热量，J/kg；ΔAm为样品结晶的总放热焓，J/kg；THA：物质熔点与冰点之间的差值，用来表示抗冻蛋白的热滞活性，℃；Th为按一定的升温速率升温使得样品为固-液混合物，此时的温度称为保留温度，℃；T0为样品溶液开始结晶的温度，℃。

1.3.4 DSC法测定抗冻蛋白的热滞活性的稳定性、专一性和精密度的评价

稳定性的评价：利用同样的测定方法，在不同时段检测会得到不同的结果，所得结果之间的相对差异越小表明其检测方法的稳定性越好。本实验以相同的测定步骤（测定的样品的蛋白浓度为1.0mg/mL左右，将升降温速率控制在1℃/min）对同一个样品进行重复多次的测定，每隔72h测定1次，每次重复3～4次，以x¯±SD表示结果，比较其结果之间差异。

专一性的评价：将待测样品平均分为3份，在10℃/min、5.0℃/min、2.5℃/min、1.0℃/min、0.5℃/min、0.1℃/min的条件下连续测定72h，平均24h检测1次，每次进行3次重复。

置信区间（1-α）和相对标准偏差（relative standard deviation，RSD）按照公式（3）、（4）计算。

式中：1-α 为置信区间，x¯为平均值，t 为随机变量，SD 为标准偏差，n 为样品数量，RSD 为相对标准偏差。

2 结果与讨论

2.1 红萝卜抗冻蛋白的分离纯化

利用SDS-PAGE测定DcAFP结果见图1。

从图1可以明显看出，分离得到的样品呈现单一条带。根据相对迁移率计算得到其相对分子质量约为36ku，与文献报导[9-10]的结果完全相符，并达到了电泳纯程度，可以用于DSC法测定THA检测方法的研究。

2.2 升降温速率对THA的影响

研究了不同升降温速率对THA的影响，结果分别见图2、图3。

从图2可以明显看出，升温速率设定为10℃/min，THA大约为0.5℃，当升温速率逐渐降低时，THA同时也会出现降低的现象，升温速率设定为0.1℃/min，THA没有被检出。

图1 DcAFP的SDS-PAGE电泳图Fig.1 SDS-PAGE electrophoretogram of DcAFP

这可能是由于在升降温速率分别为10℃/min、0.1℃/min的条件下使得吸、放热过程短暂，换热不够充分，出现热现象被放大的结果。从图2A可知，在-15℃时，体系仍在继续吸热、结晶，同理，温度大于5℃时，体系放热熔化的现象仍然存在。据此可以推断大约在0.5℃时，THA也会出现被放大的现象。

从图2D可知，升降温速率的降低至l℃/min时，体系的吸热和放热已经处于正常范围（-3℃～0.5℃），THA固定在0.1℃左右。升降温速率为0.1℃/min时，从图2可以明显看出，体系的吸热和放热过程，然而未能检出THA，这可能是因为缓慢的升温和降温过程导致仪器检测的灵敏度降低（本实验所用设备的灵敏度为0.1℃/min），未能检出THA。

由图3可知，升降温速率从0.1℃/min升为2.5℃/min时，THA变化不是很明显且趋向于稳定状态，然而升温速率增大至5℃/min、10℃/min时，THA出现迅速上升的现象，这可能是在此条件下检测信号被扩大所出现的结果。所以将1℃/min作为一个合适的升降温速率。LU M等[11-12]对THA的测定得出了同样的结论。

图2 不同升温速度检测条件下DcAFP的热流图Fig.2 Heat flow diagram of DcAFP in different heating rate

2.3 样品液中抗冻蛋白的含量对THA的影响

样品液中抗冻蛋白的含量对THA的影响结果见图4。

由图4可知，随着原料质量浓度的升高，THA也逐渐的升高。当质量浓度大于0.5mg/mL时，其THA大约稳定在0.1℃。DcAFP的溶解性较好，故其溶解度对其阈值的影响不是很大，然而本身引起的KelVin效应很有可能是影响其阈值的重要因素。通过研究发现要使得THA趋向于稳定，其质量浓度应该大于0.5mg/mL，即当样品质量浓度≥1mg/mL时，Kelvin效应最大。固本实验以1mg/mL作为DcAFP的阈值。

2.4 样品中冰晶含量对THA的影响

样品中冰晶含量对THA的影响分别见图5和图6。

由图5可知，当升降温速率从10.0℃/min逐渐降低至1.0℃/min时，样品的THA也随之降低。当升降温速率固定不变时，样品中的冰晶含量对其THA几乎没有影响。因此样品中冰晶含量的质量分数在10%～90%时，其THA几乎不受冰晶含量的影响。然而有些学者持有不同的观点，即THA会随着冰晶含量的变化而变化，且给出了THA与冰晶含量的关系，并在天牛（Rhagium inquisitor）血清抗冻蛋白中进行了验证实验，实验结果见图6[12-13]。研究学者认为该结论说明了抗冻蛋白有阻碍冰晶向细胞外生长的能力，从而可以使生活在低温恶劣的环境中生命有机体正常运转以免受到冻害损伤。ZACHARIASSEN K E等[14]将图6的曲线进一步分析推导得知，当冰晶含量小到接近0时，得出THA值为-25℃，这恰恰与水分子自由聚合的过冷冰点相吻合。上述现象在侧纹南极鱼属（Pleuragramma）中也得到了类似的结果[15]。

图3 升降温速率对DcAFP的THA影响（n≥3）Fig.3 Effect of heating and cooling rate on the THA of DcAFP

图4 DcAFP浓度对DcAFP的THA影响(n≥3)Fig.4 Effect of different DcAFP concentration on the THA of DcAFP

图5 样品中冰晶含量对THA的影响。Fig.5 Effect of ice crystal content on THA of DcAFP

图6 Longhorn beetle血清AFP中冰晶含量对THA的影响Fig.6 Effect of ice crystal in serum AFP on the THA of Longhorn beetle

由图5、图6可知，冰晶含量的范围主要位于10%～90%（质量分数），但是ZACHARIASSEN K E等[13]测定范围选取了0.13%～10%（质量分数），冰晶含量位于10%～90%（质量分数）范围内，只是通过曲线的拟合而判断其趋势。综上所述，THA会随着冰晶含量的变化而发生改变，当其值低于1%（质量分数）时，THA表现出幂指数函数的增长，而且随着冰晶含量的增长，THA会慢慢趋向于一个比较稳定的值。

2.5 DSC法测定DcAFP的THA稳定性

DSC法对测定DcAFP的THA的稳定性见图7。

图7 不同时间相同样品的THA测定结果图Fig.7 THA of the same sample determined at different time

由图7可知，利用DSC法，随机抽取时间测定同一份样品时，样品的THA在统计分析学上没有表现出显著性的差异，故可以作出判断，DSC法检测抗冻蛋白的抗冻活性具有一定的稳定性。

2.6 DSC法测定DcAFP的THA的重复性

本实验研究了不同升降温速率下样品的THA置信区间（95%）的测定结果，并且计算了相对标准偏差（RSD），其结果见表1。

表1 不同升降温速率对样品THA测定结果置信区间和相对标准偏差的影响Table 1 Effect of different warming and cooling rate on the confidence interval and relative standard deviation of different samples of THA determination results

由表1可知，在不同升降温速率条件下，其相对标准偏差（RSD）均小于0.4%，最小值和最大值分别为0.137%、0.369%，这充分说明DSC法在不同的升降温速率条件下检测抗冻蛋白的抗冻活性具有一定的重现性。

2.7 DSC法测定DcAFP的THA的精密度

对DSC法测定DcAFP的THA的精密度的研究结果见图8。

由图8可知，在相同的方法中，同一个样品连续测定的THA没有显示出明显差异性变化，THA为（0.076 06±0.001 08）℃，RSD为1.42%，说明DSC法检测抗冻蛋白的抗冻活性精密度较高。

图8 同一个样品连续测定的THA变化Fig.8 THA change of same sample measured continuously

3 结论

以DcAFP为研究对象，通过运用差示扫描量热法确定了测定抗冻蛋白热滞活性的升降温速率为1℃/min。阐述了升降温速率在0.1℃/min时检测不出其THA的主要原因。即缓慢的升温和降温过程导致仪器检测的灵敏度降低从而导致未能检出THA。

对影响测定DcAFP的THA的冰晶含量也作了系统性的解释，当样品中冰晶含量的质量分数小于1%时，THA会以幂指函数的形式上升，进一步地增加样品中的冰晶含量，THA将会稳定在某一个数值，该结果与张超等[16-17]文献中报道的实验结果基本相同。

最后叙述了利用DSC法测定DcAFP的THA的稳定性较高；在不同升降温速率条件下其重复性相对标准偏差（RSD）均在0.4%以下；通过相同方法检测同一个样品没有表现出明显的差异性，相对标准偏差为1.42%，精密度高。因此差示扫描量热法可以有效的测定抗冻蛋白的热滞活性。

[1]GRAETHER S P,SYKES B D.Cold survival in freeze-in-tolerant insects[J].Eur J Biochem,2004,271(16):3285-3296.

[2]CELIK Y,GRAHAM L A,MOK Y F,et al.Superheating of ice crystals in antifreeze protein solutions[J].P Natl Acad Sci USA,2010,107(12):5423-5428.

[3]邵 强，李海峰，刘国生，等.抗冻蛋白的抗冻活性及其测定方法[J].平原大学学报，2005，22（4）：111-113.

[4]ZHANG C,ZHAO X Y,MA Y,et al.Determination of thermal hysteresis activity of antifreeze protein by differential scanning calorimetry[J].Acta Biophysica Sinica,2008,24(6):465-473.

[5]GUERRERO P,DE LA CABA K.Thermal and mechanical properties of soy protein films processed at different pH by compression[J].J Food Eng,2010,100(2):261-269.

[6]黄晓毅，韩剑众，王彦波，等.差示扫描量热技术（DSC）在肉类研究中的应用进展[J].食品工业科技，2009，30（6）：353-357.

[7]MEYER K,KEIL M,NALDRETT M J.A leucine-rich repeat protein of carrot that exhibits antifreeze activity[J].Febs Lett,1999,447(2-3):171-178.

[8]LAEMMLI U K.Cleavage of structure proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J].Nature,1970,277(5259):680-685.

[9]ZHANG D Q,LIU B,FENG D R,et al.Expression,purification,and antifreeze activity of carrot antifreeze protein and its mutants[J].Protein Expres Purif,2004,35(2):257-263.

[10]SAMLLWOOD M,WORRALL D,BYASS L,et al.Isolation and characterization of a novel antifreeze protein from carrot(Daccus carota)[J].Biochem J,1999,340(2):358-391.

[11]LU M,WANG B,LI Z,et al.Differential scanning calorimetric and circular dichroistic studies on plant antifreeze proteins[J].J Therm Anal Calorim,2002,67(3):689-698.

[12]HANSEN T N,BAUST J G.Serial dilution of Tenebrio-Molitor hemolymph-analysis of antifreeze activity by differential scanning calorimetry[J].Cryo-Letters,1989,9(6):386-391.

[13]ZACHARIASSEN K E,HUSBY J A.Antifreeze effect of thermal hysteresis agents protects highly supercooled insects[J].Nature,1982,298(5877):865-867.

[14]ZACHARIASSEN K E,KRISTIANSEN E.Ice nucleation and antinucleation in nature[J].Cryobiology,2000,41(4):257-279.

[15]WOHRMANN A P A.Antifreeze glycopeptides and peptides in Antarctic fish species from the Weddell Sea and the Lazarev Sea[J].Mar Ecol-Prog Ser,1996,130(1-3):47-59.

[16]张 超，赵晓燕，马 越，等.使用差示扫描量热仪测定抗冻蛋白热滞活性方法的研究[J].生物物理学报，2008，24（6）：465-471.

[17]张 超.冬小麦麸皮抗冻蛋白结构及其抗冻机理的研究[D].无锡：江南大学博士论文，2008.