两种生产用米曲霉的形状及蛋白酶性质研究

曾小波，刘 滢，朱新贵，李 理*

（1.李锦记（新会）食品有限公司，广东 江门 529156；2.华南理工大学轻工与食品学院，广东 广州 510640）

酱油酿造过程中，菌种的作用至关重要。目前国内大多数酱油生产厂家所用的菌种为沪酿3.042及从该菌种诱变筛选而来的菌种。沪酿3.042具有生长快、蛋白酶活力较高、产孢子量大、抗杂菌等优点，但其蛋白酶活力仍然不够高，且以中性和碱性蛋白酶为主，酸性蛋白性较弱，导致蛋白质利用率保持在75%左右的水平。而日式酱油，由于其菌种技术的发展，其蛋白质利用率已达到92%的水平[1]。因此菌种的选育和研究对酱油生产企业有极其重要的作用。

本企业在长期的生产实践过程中，从最初的米曲霉3.042中不断地诱变筛选，获得了两个各具优点、性状不同的菌株。为了对这两株菌种有系统的认识，从而为生产控制提供数据支持，并为进一步筛选优良菌种提供理论依据，研究比较了2株米曲霉的基本性状，同时分析了成曲粗酶液中蛋白酶的酶学性质，研究结果可用于企业生产。

1 材料与方法

1.1 主要材料

米曲霉1号、米曲霉2号：生产用种，从沪酿3.042米曲霉中筛选获得。

种曲、成曲：李锦记（新会）食品有限公司车间提供。

察氏培养基：购于广东环凯微生物科技有限公司。

双层酪蛋白培养基：底层：琼脂粉15g，加蒸馏水1 000mL，煮沸溶解后于121℃灭菌20min，每个平皿加约8mL；上层：Na2HPO4·12H2O 1.07g，KH2PO40.36g，BaCl25.0g，酪蛋白4.0g，琼脂15g，蒸馏水1 000mL。配制时，酪蛋白先用20mL溶解，再与900mL水及除BaCl2外的其他药品混合。BaCl2则用100mL水单独溶解，各自在121℃灭菌20min，使用前混合。上层培养基每个平皿定量8mL。

豆汁培养基：5°Bé豆汁1 000mL，硫酸镁0.5g，可溶性淀粉20g，磷酸二氢钾1g，硫酸铵0.5g，琼脂20g，pH6.0，121℃灭菌20min。

1.2 仪器与设备

XSP-8C光学显微镜：上海绘统光学仪器厂；UV-1100可见分光光度仪：北京莱博泰科仪器有限公司；SL1545恒温培养箱：东南化学仪器有限公司；0～200mm游标卡尺：中国机械进出口公司。

1.3 试验方法

1.3.1 菌落形态观察

察氏培养基和豆汁培养基倒平板后，将孢子稀释涂布于平板，倒置于培养箱中31℃培养，每隔一段时间观察菌落形态，并测定菌落的直径。

1.3.2 显微镜观察

载玻片培养观察法：将察氏培养基灭菌后冷却至45℃左右，接入适量米曲霉孢子，摇匀后，迅速取培养基于无菌载玻片上，盖上盖玻片，将载玻片放入无菌平皿中，然后置于30℃恒温培养箱中培养，每隔一段时间将载玻片取出，在显微镜下观察菌丝生长情况[2]。

1.3.3 产酶能力

将双层酪蛋白培养基倒入平皿后，将稀释后的孢子涂布于平皿，倒置于培养箱中培养，每隔一段时间测定菌落直径d1和透明圈直径d2，计算K值（K=d2/d1）。

1.3.4 酶学性质研究

最适酶促反应温度：在pH7.2，不同温度条件下（温度分别为35℃、40℃、45℃、50℃、55℃、60℃）测定蛋白酶活力。

最适酶促反应pH：配制不同pH值的磷酸盐缓冲液和乳酸盐缓冲液。在40℃，不同pH条件下（pH值为3、4、5、6、7、8、9、10）测定蛋白酶活力。

不同盐含量条件下的粗酶蛋白酶活力：在40℃，pH7.2的条件下，测定粗酶酶液在不同盐含量条件下（盐含量分别为0、5%、10%、15%、20%、25%）的蛋白酶活力。

1.3.5 测定方法

样品处理：将待测样品混合均匀，称取10g样品于研钵内，先加入蒸馏水20mL，静止浸泡10min，然后小心将每颗成曲表皮磨下，倒入250mL三角瓶内，加入蒸馏水使三角瓶内样品加水的质量共100g，摇匀，置于40℃水浴间断振摇1h，取出摇匀后过滤，此滤液用缓冲液稀释5倍，即制得稀释50倍的提取液，备用。

采用福林法蛋白酶活力测定，按SB/T 10317—1999《蛋白酶活力测定法》进行测定，在40℃、pH7.2条件下每分钟水解酪蛋白产生1μg酪氨酸，定义为一个蛋白酶活力单位。淀粉酶活力测定参考3，5-二硝基水杨酸法[3]测定，在40℃条件下每分钟水解淀粉产生1mg麦芽糖，定义为一个淀粉酶活力单位。果胶酶活力测定采用3，5-二硝基水杨酸法[4]测定，1mL酶液在50℃、pH3.5的条件下，1h分解果胶产生1mg半乳糖醛酸为一个酶活力单位。

2 试验结果与分析

2.1 形态特征

2.1.1 菌落形态

将两株米曲霉分别稀释一定倍数涂布在察氏平板和豆汁平板上，置于31℃培养3～5d。米曲霉的菌落形态描述见表1。

表1 两株米曲霉的菌落形态比较Table 1 Colony morphology of two strains of A.oryzae

由表1可知，两株米曲霉的菌落在颜色以及形态上均有差异。

将两株米曲霉孢子稀释到一定倍数后分别涂布在豆汁平板培养基上，置于不同的温度条件下培养，每天观察米曲霉生长情况，并测定菌落直径，结果见表2。

由表2可知，在同一时间，米曲霉1号的菌落都比米曲霉2号的菌落大，由此可以推出米曲霉1号比米曲霉2号生长得快。由表2还可以得知，两株米曲霉均在31℃、36℃时生长速度较快，温度过高（41℃）时，米曲霉不生长，而温度较低时（26℃），米曲霉生长缓慢。

2.1.2 细胞形态

利用载玻片培养法观察米曲霉不同生长阶段的显微形态，结果见表3。

由表3可知，米曲霉的生长大致可分3个阶段：孢子发芽期、菌丝生长期和产孢子期。两株米曲霉的孢子均近似圆形，顶囊呈烧瓶形，小梗单层，孢子穂呈扫帚形或半球形。两者的区别是：米曲霉1号发芽较米曲霉2号快，产孢子也较早，这与2.1.1得到的结果相符。此外，米曲霉1号的孢子呈线状排列，延伸较长，表现为成曲时孢子较多，而米曲霉2号的孢子囊成簇拥状，孢子较少。

表2 不同温度下两株米曲霉的生长情况比较Table 2 Growth states of two strains of A.oryzae under different temperature conditions

表3 米曲霉不同生长阶段的细胞形态Table 3 Cell morphology in different growth stages of two strains of A.oryzae

2.1.3 种曲形态

两株米曲霉制成的种曲见图1。

观察种曲形态（图1）可知，米曲霉1号种曲呈黄绿色（偏黄），菌丝较短，结块较少，孢子多；米曲霉2号种曲呈黄绿色（偏绿），菌丝较长，易结块，孢子多。

2.1.4 成曲形态

两株米曲霉制成的黄豆成曲见图2。

观察成曲形态（图2）可知，米曲霉1号成曲黄绿色，孢子较多，菌丝较短；而米曲霉2号菌丝较长，孢子较1号少，颜色比1号白。

图1 两株米曲霉的种曲形态Fig.1 Koji morphology of two strains of A.oryzae

图2 两株米曲霉的成曲形态Fig.2 Mature koji morphology of two strains of A.oryzae

2.2 平皿产酶能力的对比

两株米曲霉在双层酪蛋白培养基中培养48h、60h、72h、84h时，分别测定菌落直径d1及透明圈直径d2，并计算菌种的K值（K=d2/d1），结果见表4。

表4 两株米曲霉在酪蛋白平板上K值的比较Table 4 K values of two strains of A.oryzae in casein plate

由表4可知，米曲霉2号的菌落直径远小于米曲霉1号，但其K值明显大于米曲霉1号。根据文献[5-6]，K值和菌落直径的大小共同决定了米曲霉蛋白酶活力的高低，当菌落直径相近时，K值大的产蛋白酶活力高；而当K值相近时，菌落大的产蛋白酶活力高，但哪个因素对蛋白酶活力影响更大并未提及。张玉涛等[7]对多株米曲霉的菌落直径（D）和K值对蛋白酶活（U）的影响进行回归分析，得出这样一个关系：U=1.30K+0.032D-1.26。这个公式在一定程度上说明了K值对蛋白酶活力影响更大。根据实验测定及生产数据，发现米曲霉2号的蛋白酶活力始终大于米曲霉1号，这进一步说明K值对蛋白酶活的影响更大。因此，在利用酪蛋白平板对菌种进行初筛时，应首先考虑K值大小，其次再考虑菌落大小。

2.3 不同酶的活力比较

表5 两株米曲霉不同酶的活力比较Table 5 Different enzyme activity of two strains of A.oryzae

由表5可知，曲培养44h后，两株米曲霉的淀粉酶酶活力差异较小，米曲霉2号要稍低于米曲霉1号，而果胶酶和蛋白酶活力则是米曲霉2号高于米曲霉1号，其中蛋白酶活力要远远高于米曲霉1号。这说明，在酶活力方面，米曲霉2号更有优势。

2.4 成曲蛋白酶性质对比

2.4.1 两株米曲霉产酶活力的周期

在制成曲时，开始0～20h不取样，在20h、24h、28h、32h、36h、40h、44h、48h、52h时抽样检测中性蛋白酶活力，作出不同时间的酶活力关系曲线，找出最高中性蛋白酶酶活力的大致时间段，结果见图3。

图3 成曲制作过程中的蛋白酶活力变化Fig.3 Variation of protease activity in the process of mature koji production

由图3可知，随着培养时间的延长，成曲的蛋白酶活力呈逐渐上升的趋势，到达一定值后趋于稳定或略微下降。米曲霉1号和2号的成曲均在培养40h左右，蛋白酶活力达到最大值，但米曲霉2号的最大酶活力远远高于米曲霉1号。

2.4.2 不同pH条件下成曲蛋白酶活力的曲线

配制pH3～10的磷酸盐缓冲液或乳酸盐缓冲液。按照福林法步骤测定酶活力，结果见图4。

从图4可知，米曲霉2号明显比1号的蛋白酶活力高。在pH3～7的区间，米曲霉2号的酶活力上升较明显，在pH7左右有一个酶活力峰，而后开始缓慢下降，至pH9时有最高酶活力峰，说明米曲霉2号成曲蛋白酶多为碱性蛋白酶。而米曲霉1号在大约pH6的时候有最高峰，pH9时也有一个酶活力峰，但较pH6低，说明米曲霉1号菌的最适反应pH值为6，其碱性蛋白酶相对较弱。以上说明这两个菌株是米曲霉的不同菌株，两个菌株在蛋白酶活力的最高峰值的pH值不同，且蛋白酶活力的值相差较大。与前期观察结果相符合。

图4 成曲不同pH条件下测定的蛋白酶活力Fig.4 Protease activity of mature koji under different pH conditions

2.4.3 不同温度条件下成曲蛋白酶活力的曲线

图5 成曲在不同温度下测定的蛋白酶活力Fig.5 Protease activity of mature koji under different temperature

由图5可知，在35～60℃之间，随着温度的升高，两株米曲霉的成曲蛋白酶活力均先升高后降低，但米曲霉1号的最适酶促反应温度为45℃，米曲霉2号的最适酶促反应温度为50℃，且2号的酶活远高于1号。

2.4.4 成曲蛋白酶的耐盐曲线

图6 成曲在不同氯化钠浓度下测定的蛋白酶活力Fig.6 Protease activity of mature koji under different sodium chloride concentration

由图6可知，随着盐分含量的增高，两株米曲霉的成曲蛋白酶活力均逐渐降低，在20%氯化钠条件下，蛋白酶活力均降至无盐条件下的20%～30%。但米曲霉2号的蛋白酶活力在不同的盐分含量下始终是米曲霉1号的2倍多。

3 结论

由米曲霉形态特征及蛋白酶性质等方面的比较可知，2株米曲霉是不同的菌株，有着明显的差异。米曲霉1号菌落较大、发芽和产孢子较快，种曲及成曲颜色偏黄，菌丝较短，孢子较多；而米曲霉2号菌落较小，孢子发芽时间及产孢子时间比1号晚，成曲孢子较1号少，但菌丝长且粗壮，种曲颜色偏绿，成曲颜色偏白。米曲霉2号的产酶能力强。

蛋白酶性质的研究结果显示，成曲的蛋白酶性质有差异，1号和2号的最适反应温度分别为45℃和50℃，最适反应pH分别为6.0和9.0。在生产应用过程中，两菌株各有优缺点，其生产性能同其形态和酶学性质等有密切的相关性，因此对两株菌种的基本性状及酶的研究对企业生产极为重要。

本研究仅从基本的微生物形态和酶活力等方面进行实验，在分子生物学、基因层面还有待进一步研究。

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