子宫内膜癌中CDK4和ki67的表达及其意义

王雅楠，孔卫平，孙冬霞

子宫内膜癌为女性生殖道常见恶性肿瘤之一，其发病率在女性恶性肿瘤中居第二位。CDK4作为一种细胞周期正向调节因子已被证实是一种癌基因，在许多实验性肿瘤的发生发展过程中起重要作用［1］。本研究采用免疫组化染色SP法检测正常子宫内膜、子宫内膜癌组织中CDK4和ki67蛋白的表达情况，并分析CDK4和ki67在子宫内膜癌中的表达情况与生物学行为的关系，以期为临床诊断、病情监测和预后评估提供理论依据。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取2007年2月—2013年5月邯郸市中医院和邯郸市妇幼保健院妇科收治的子宫内膜癌患者60例，年龄45～67岁，平均53.1岁。癌组织的病理分期:Ⅰ期15例，Ⅱ期24例，Ⅲ期12例，Ⅳ期9例;组织学分级:G1级36例，G2级13例，G3级11例。侵犯及浸润深度:局限于黏膜层及浸润≤1/2肌层44例，浸润＞1/2肌层16例。所有患者留取标本前未行放、化疗及激素治疗。另外选取同期子宫肌瘤或子宫脱垂而手术切除子宫的正常子宫内膜标本 (均为分泌期子宫内膜)32例，年龄46～67岁，平均51.6岁。

1.2 仪器与试剂 仪器:切片机 (德国LAIKA)、光学显微镜 (日本OLYMPUS)、恒温烤箱 (中国山东潍坊)、电热恒温培养箱 (余姚市远东数控仪厂)、自动漂片仪 (中国安徽电子科学研究院)等。试剂:SP试剂盒、二硝基联苯胺 (DAB)显色液及CDK4多克隆抗体 (购自博士德公司)，ki67检测试剂盒 (购自北京中杉金桥生物技术有限公司)。

1.3 方法 采用免疫组化染色SP法检测CDK4和ki67的表达情况，阳性对照为乳腺癌组织切片，阴性对照以PBS缓冲液代替一抗，操作步骤严格按照试剂盒操作说明书进行。

1.4 结果判定 CDK4及ki67阳性染色均定位于肿瘤细胞核，在细胞核内出现棕黄色颗粒为阳性细胞。阳性标准采用Parenti等［1］的计数标准，具体方法:每张切片随机选5个高倍视野(×400)进行计数，阳性细胞数＜5%为 (－)，5% ～25%为(+)，26% ～50%为 (++)，＞50%为 (+++)。－为阴性表达，+～+++为阳性表达。

1.5 统计学方法 应用SPSS 13.0统计学软件进行数据处理，计数资料采用χ2检验;CDK4与 ki67阳性表达的关系采用Spearman相关分析，以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CDK4和ki67在正常子宫内膜、子宫内膜癌组织中的表达情况 子宫内膜癌组织中CDK4和ki67表达定位于细胞核，其在子宫内膜癌组织中阳性表达率分别为78.3%(47/60)、85.0%(51/60);CDK4和ki67在正常子宫内膜组织中的阳性表达率分别为25.0%(8/32)和12.5%(4/32)。CDK4和ki67在子宫内膜癌组织中的阳性表达率高于正常子宫内膜组织(P ＜0.05)。

2.2 CDK4和ki67在子宫内膜癌中的表达与临床病理特征的关系 在组织学分级G2～G3级、临床分期Ⅲ～Ⅳ期、有淋巴结转移的患者中CDK4和ki67的阳性表达率分别高于组织学分级G1级、临床分期Ⅰ～Ⅱ期、无淋巴结转移患者 (P＜0.05);子宫内膜癌患者不同浸润深度及病理类型间CDK4和ki67的阳性表达率比较，差异均无统计学意义 (P＞0.05，见表1)。

表1 子宫内膜癌患者CDK4和ki67的表达与临床病理特征的关系Table1 Relationship of the expression of CDK4 and ki67 in endometrial carcinoma with clinicopathologic factor

2.3 CDK4和ki67在子宫内膜癌组织中的相关性 在子宫内膜癌组织中CDK4与ki67的表达呈正相关 (r=0.459，P＜0.05)。

3 讨论

肿瘤可以认为是一类细胞周期病。细胞周期是一高度有序的分子事件，各时相严格按照G1－S－G2－M的顺序进行。CDK是细胞周期蛋白依赖性蛋白激酶 (cyclin－depend－entkinases，CDKs)家族的成员之一，CDK4基因定位于12q13染色体，含有3个外显子及2个内含子，人类CDK4是由34个氨基酸组成的蛋白质，是细胞周期G1期的正调控因子［2］。作用机制为CDK4通过Cyclin D激活与之形成复合物，Rb蛋白发生磷酸化，释放转录因子E2F，E2F使得几个重要的DNA合成基因发生转录，使DNA合成得以进行，细胞由G1期进入S期，从而使细胞分裂、增殖，在细胞周期起到了正调节作用，CDK4是一种癌基因，相关报道证实在黑色素瘤［3］、大肠癌［4］、宫颈癌［5］、胃癌［6］等中 CDK4 的基因扩增和蛋白表达失调。本研究结果显示，CDK4蛋白结果显示其阳性表达主要位于细胞核内，CDK4的核表达可能有助于细胞的增殖过程，在子宫内膜癌组织中呈过度表达，在正常子宫内膜组织中低表达，表明在子宫内膜癌中CDK4的过度表达对肿瘤的发生起到了促进作用;CDK4的过度表达与子宫内膜癌的病理分期、组织学分级、淋巴结转移有关，表明CDK4的过度表达在一定程度上可以反映子宫内膜癌的生物学特性，对子宫内膜癌的病程进展、肿瘤分化、发展起到促进作用，说明其表达水平越高、肿瘤的侵袭力越强、恶性度就越高。总之可以认为CDK4过度表达可加速细胞增殖，促进肿瘤细胞异常增生、浸润和肿瘤复发而导致预后不良。

ki67是一种与细胞增殖密切相关的大分子蛋白，分布于细胞核内，属于IgG家族，是目前临床上广泛应用的检测细胞增殖的标志，是可靠而迅速地反映恶性肿瘤增殖率的指标，其高表达是细胞增殖活跃的重要标志。ki67在除了G0期之外的所有细胞周期中均有表达，在G1后期开始出现，S期、G2期升高，M期达高峰，其后迅速降解，ki67主要分布于增生性的或高转化性的组织中，而在一些被认为是非增生性的或低转化性的组织中，ki67几乎不表达，说明ki67与细胞的合成代谢有关，其表达的高低反映了细胞增殖的程度。近年来ki67单克隆抗体已广泛应用于研究肿瘤和非肿瘤组织细胞增生活性，有研究表明，其与恶性肿瘤的发展、转移和预后高度相关，ki67与肿瘤恶性程度关系基本一致，随着恶性程度的发展而增高。ki67抗原表达情况主要反映恶性肿瘤细胞的增殖活性，有关资料证实其与恶性肿瘤的发展、转移和预后高度相关［7］。另外相关学者研究发现ki67的表达情况能够体现出恶性肿瘤细胞分化低、增殖快的特点，可以认为ki67高表达是肿瘤发生发展的早期事件［8－9］。本研究结果显示，在子宫内膜癌组织中ki67阳性表达主要定位于细胞核，呈过度表达，明显高于正常内膜组织，ki67与子宫内膜癌的病理分期、组织学分级、淋巴结转移有关。因此，子宫内膜癌中ki67的高表达可提示肿瘤细胞增殖活跃、侵袭性强、易发生转移、预后不良。综上所述，ki67能客观反映子宫内膜癌的增殖活性，可以作为评价子宫内膜癌发生、发展和预后的重要指标之一。

同时，笔者对CDK4和ki67在子宫内膜癌组织中的表达进行相关性分析，发现CDK4和ki67的表达在子宫内膜癌中呈正相关，CDK4是细胞周期G1期的正调控因子，ki67在细胞周期G1期开始发挥作用，两者在细胞增殖方面应该存在联系，这种联系会促进子宫内膜癌的发生、进展，两者的监测工作对子宫内膜癌诊断治疗、评价预后有重要参考价值，可以作为评价子宫内膜癌生物学行为的重要指标之一。联合检测CDK4和ki67在子宫内膜癌组织中的表达情况有助于指导临床治疗，为子宫内膜癌防治探索新思路。

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