蒺藜提取物对小鼠睾丸热损伤后NOS-NO系统的影响*

田洪艳 李质馨徐 冶 潘晓燕 王弘珺 刘忠平 林冬静

吉林医药学院组织学与胚胎学教研室（吉林 132013）

蒺藜提取物对小鼠睾丸热损伤后NOS-NO系统的影响*

田洪艳 李质馨**徐 冶 潘晓燕 王弘珺 刘忠平 林冬静

吉林医药学院组织学与胚胎学教研室（吉林 132013）

目的观察蒺藜提取物对小鼠热损伤睾丸一氧化氮合酶（NOS）-一氧化氮（NO）系统的影响，探讨蒺藜对小鼠热损伤睾丸的保护修复作用机制。方法健康雄性小鼠30只，随机分为对照组、模型组和给药组，每组10只；建立睾丸热损伤模型，给予治疗剂量的蒺藜提取物；睾丸NOS活力和NO含量测定；睾丸NOS 和caspase-3免疫组织化学染色，光学显微镜观察；酶联法检测血清中睾酮含量。结果模型组与对照组相比睾丸组织NOS活力和NO含量明显升高，睾丸iNOS阳性表达明显增加，睾丸caspase-3阳性细胞明显增多，血清睾酮含量明显降低。给药组与模型组相比睾丸组织NOS活力和NO含量明显降低，睾丸iNOS阳性表达明显减少，睾丸caspase-3阳性细胞明显减少，血清睾酮含量明显升高。结论 蒺藜提取物通过调控NOS-NO系统，实现对小鼠热损伤睾丸的保护修复作用。

蒺藜; 热损伤; 睾丸; 一氧化氮合酶; 一氧化氮

一氧化氮（nitric oxide，NO）是一种具有广泛生物学效应的气体信号分子，由一氧化氮合酶（nitric oxide synthase，NOS）催化L-精氨酸与氧分子经多步氧化还原反应生成，可由多种类型的细胞产生。NO以自分泌和旁分泌形式作用于组织细胞，参与机体多种生理和病理反应过程[1,2]。NO的生物半衰期仅数秒,因此细胞产生NO量的多少关键取决于NOS的活性。目前在哺乳动物体内发现3种亚型NOS，即神经元型一氧化氮合酶（neuronal NOS，nNOS）、诱导型一氧化氮合酶（inducible NOS，iNOS）和内皮型一氧化氮合酶（endothelial NOS，eNOS）。NO在生殖系统中的作用已被广大学者所关注，研究表明NO与阴茎勃起、睾丸微循环调节、雄激素分泌、精子成熟、运动及获能等生殖活动均有密切关系[3-6]。中医学指出蒺藜具有促进精子产生、提高生殖能力等作用，但这仅限于中医临床观察，且只是表征的描述。本文是从睾丸NOS-NO系统的变化，探讨蒺藜提取物对小鼠热损伤睾丸的保护修复作用机制。

材料和方法

一、材料

（一）实验动物和分组

选用健康清洁级ICR雄性小鼠，30只，体质量（25±2）g，购自吉林大学动物实验中心。将30只小鼠随机分为对照组、模型组和给药组，每组10只，分笼饲养，饲养温度为18～22℃，相对湿度45%～55%，规律光照，自由饮食，适应性饲养1周后开始实验。

（二）主要试剂与仪器

蒺藜提取物，棕黄色粉末，陕西森弗生物技术有限公司；多聚甲醛，国药集团化学试剂有限公司；NOS测定试剂盒、NO测试盒和考马斯亮兰蛋白测定试剂盒，南京建成生物工程研究所；睾酮（testosterone，T）ELISA检测试剂盒，美国；兔抗鼠iNOS多克隆抗体、兔抗鼠caspase-3多克隆抗体、SABC免疫组织化学染色试剂盒、DAB 显色试剂盒，武汉博士德生物工程有限公司。三用恒温水箱，上海精宏实验设备有限公司；TDZ5-WS型离心机，长沙湘仪离心机有限公司；MK3型酶标仪，美国热电公司；723型可见分光光度计，上海光谱仪器有限公司；微量电动匀浆器，美国kimble公司；Leica-RM2245石蜡切片机，德国；OLYMPUS-DP71数码显微镜，日本。

二、方法

（一）建立动物模型

小鼠均用0.4%戊巴比妥钠0.8～1.2mL/只，腹腔注射麻醉。热处理参照Lue等方法[7]，模型组和给药组小鼠麻醉后，阴囊浸于43℃恒温水浴中，20min；对照组小鼠麻醉后，阴囊浸于22℃恒温水浴中，20min。各组均于热处理前4天开始灌胃，每天1次；给药组灌服蒺藜提取物，390mg/kg；对照组和模型组灌服等量的蒸馏水；连续灌胃至热处理后3d，取材进行标本制备。

（二）血清T含量测定

0.4%戊巴比妥钠0.8～1.2mL/只，腹腔注射麻醉；心脏穿刺取血；分离血清；酶联法检测血清中T含量，检测方法按照试剂盒说明书进行。

（三）睾丸NOS活力和NO含量测定

处死小鼠，立即取睾丸，经预冷生理盐水漂洗，滤纸拭干，除去皮下脂肪和其他结缔组织，称量；量取该组织块9倍质量的预冷生理盐水，用微量电动匀浆器制成10%组织匀浆；反复冻融3次，使细胞完全破碎，内容物完全游离在液相中；离心，取上清液；测定NOS活力和NO含量，测定方法按照试剂盒说明书进行。

（四）NOS免疫组织化学染色

取睾丸，放入4%多聚甲醛中固定；常规脱水、透明，石蜡包埋；石蜡切片机切片，5μm。釆用SABC法进行iNOS免疫组织化学染色。染色步骤按试剂盒说明书进行，用正常非免疫血清代替一抗作替代对照，用不加一抗的缓冲液作空白对照，DAB显色，苏木精复染，光学显微镜下观察。iNOS免疫组织化学染色阳性表达产物呈棕黄色，定位于细胞质。用Image-Pro Plus分析软件对iNOS的表达进行定量分析，每组随机选取30个视野（×400），测定每个视野下阳性反应的平均光密度。

（五）caspase-3免疫组织化学染色

石蜡切片制作同上，釆用SABC法进行caspase-3免疫组织化学染色。染色步骤按试剂盒说明书进行，用正常非免疫血清代替一抗作替代对照，用不加一抗的缓冲液作空白对照， DAB显色，光学显微镜下观察，caspase-3阳性细胞呈棕黄色。每组随机选取30个视野（×200），计数caspase-3阳性细胞数。

三、统计学处理

应用SPSS13.0统计软件处理，实验数据以均数±标准差（±s）表示，釆用单因素方差分析（One-Way ANOVA）进行实验结果的差异性检验，分析前进行方差齐性检验，P＜0.05为差异具有统计学意义。

结 果

一、睾丸NOS活力的变化

对照组睾丸组织NOS活力为（1.337±0.057）U/mg prot；模型组睾丸组织NOS活力为（2.370± 0.065）U/mg prot，与对照组比较活力明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；给药组睾丸组织NOS活力为（1.547±0.052）U/mg prot，与模型组比较活力明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

二、睾丸NO含量的变化

对照组睾丸组织NO含量为（3.192±0.067）μmol/g prot；模型组睾丸组织NO含量为（4.272± 0.073）μmol/g prot，与对照组比较含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）；给药组睾丸组织NO含量为（3.377±0.071）μmol/g prot，与模型组比较含量明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

三、睾丸iNOS阳性细胞的表达

睾丸iNOS阳性细胞为多边形，核圆居中，胞质呈棕黄色，主要分布于睾丸间质（图1）。对照组iNOS阳性细胞数量少，胞质显色淡，iNOS阳性反应的平均光密度为0.1386±0.0076；模型组iNOS阳性细胞数量增多，胞质显色较深，iNOS阳性反应的平均光密度为0.2173±0.0145，明显高于对照组（P＜0.01）；给药组iNOS阳性细胞数量减少，胞质显色较淡，iNOS阳性反应的平均光密度为0.1637± 0.0073，明显低于模型组（P＜0.01）。

四、睾丸caspase-3阳性细胞的变化

caspase-3阳性细胞呈棕黄色，主要分布于生精细胞（图2）。对照组caspase-3阳性细胞少，caspase-3阳性细胞数为1.167±0.986；模型组caspase-3阳性细胞增多，caspase-3阳性细胞数为9.433±1.775，明显高于对照组（P＜0.01）；给药组caspase-3阳性细胞减少，caspase-3阳性细胞数为3.133±1.196，明显低于模型组（P＜0.01）。

五、血清T含量的变化

对照组血清T含量为（1.926±0.056）ng/mL；模型组血清T含量为（1.298±0.052）ng/mL，与对照组比较含量明显降低，差异具有统计学意义（P＜0.01）；给药组血清T含量为（1.803±0.072）ng/mL，与模型组比较含量明显升高，差异具有统计学意义（P＜0.01）。

图1 各组小鼠睾丸iNOS阳性细胞（SABC法）

图2 各组小鼠睾丸caspase-3阳性细胞（SABC法）

讨 论

NO一方面作为一种信使分子参与体内的各种重要生理功能[1]；另一方面NO还是一种细胞毒性分子，可造成组织细胞损伤，过多的NO生成与某些疾病的发生发展关系密切[8]。NO具有良好的亲脂性，可快速通过细胞膜扩散，到达邻近靶细胞发挥作用。NO在体内的作用，可通过激活鸟苷酸环化酶（GC），使环鸟甘酸（cGMP）升高而完成；也可以与体内众多生物分子直接发生反应而参与，这时不依赖cGMP。机体对NO作用的调节主要是通过对NOS的调控来实现，NOS是唯一催化NO合成的酶分子，目前已纯化了3种同工酶（nNOS、iNOS，eNOS），从功能上可把NOS分为结构型（nNOS、eNOS）和诱导型（iNOS）两种。nNOS和eNOS是通过机体对Ca2+水平的控制而低水平持续表达，使NO维持在低浓度发挥生理功能；iNOS可通过诱导合成，一旦合成即产生大量NO。iNOS是引起体内NO过量产生的主要基础，大量NO可以造成组织和细胞的损害甚至死亡，所以iNOS的诱导合成就成为众多疾病的发病关键[8]。NO对雄性生殖功能亦具有重要的调节作用，与男性不育有着密切的关系。因此，近年来对NO的研究越来越受到广大生殖医学工作者的重视[3-6]。在我们的实验中观察到模型组与对照组相比NOS活力和NO含量明显升高，睾丸iNOS阳性表达增加；给药组与模型组相比NOS活力和NO含量明显降低，睾丸iNOS阳性表达明显减少；表明蒺藜提取物可通过调控睾丸组织NOS-NO系统，实现对小鼠热损伤睾丸的保护修复作用。

细胞凋亡是细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序自己结束生命的过程。细胞凋亡不仅参与生物体的生长发育，也介导了一些疾病的发生发展。近年来，生精细胞凋亡的研究已成为一个热点，尤其是对不育症的研究也给予了较多关注[9,10]。随着细胞凋亡机制和调控的阐明，将有助于探讨生精细胞凋亡与男性不育的关系。研究表明NOS和NO参与睾丸组织细胞的分化和凋亡的调控，NOS缺乏或NOS表达增强可以减少或增加细胞凋亡[11,12]。高浓度的NO是一种重要的凋亡诱导因子。NO可直接损伤细胞的DNA，诱导细胞凋亡；NO与O2-•结合生成ONOO-，后者可直接或通过分解成许多小分子毒性物质损伤细胞，从而诱导细胞凋亡；NO可影响多种凋亡相关基因而诱导凋亡。caspase-3是细胞凋亡过程中最关键的执行分子之一，可以剪切细胞凋亡过程中的许多关键蛋白，caspase-3的激活常被作为细胞凋亡的一个重要指标。在我们的实验中观察到模型组与对照组相比，caspase-3阳性细胞明显增多，同时睾丸组织NOS活力和NO含量显著增高，睾丸iNOS阳性表达增加；给药组与模型组相比，caspase-3阳性细胞明显减少，同时睾丸组织NOS活力和NO含量明显降低，睾丸iNOS阳性表达明显减少；表明蒺藜提取物可通过NOS-NO系统调控睾丸生殖细胞的凋亡。

精子发生是一个高度复杂的细胞分裂分化过程，并且易受到许多内、外源性致病因素的影响[13,14]。睾丸各细胞间存在着复杂的旁分泌调节机制，许多细胞还有自分泌调节功能。睾丸生精上皮中的生精细胞是在许多旁分泌因子及自分泌因子形成的局部激素环境中进行增殖、分裂和分化的。睾酮是启动和维持精子发生的最重要激素，睾酮形成后被动扩散入生精上皮，与雄激素结合蛋白结合，促进精子发生。研究结果证实，睾酮分泌与NO关系密切，NO对睾酮的分泌具有双向调节作用。NO在低浓度时可以通过cGMP介导作用刺激睾酮的分泌，在高浓度时则抑制睾酮的分泌[15]。在我们的实验中观察到模型组与对照组比较，小鼠血清T含量明显降低，同时睾丸组织NOS活力和NO含量显著增高，睾丸iNOS阳性表达增加；给药组与模型组比较，小鼠血T含量明显升高，同时睾丸组织NOS活力和NO含量明显降低，睾丸iNOS阳性表达明显减少；表明蒺藜提取物可通过NOS-NO系统调控T的分泌，进而调节精子的发生。

1 杨学礼, 冯娟. 一氧化氮的生物效应及其作用机制的研究—1998年诺贝尔生理学或医学奖工作介绍及研究进展. 生理科学进展 2008; 39(1): 91-95

2 边宁, 龚博君, 郭军, 等.一氧化氮/诱导型一氧化氮合酶在动脉粥样硬化过程中的作用. 中国病理生理杂志2014; 30(3): 414-418

3 Balercia G, Moretti S, Vignini A,et al. Role of nitric oxide concentrations on human sperm motility.J Androl2004; 25 (2): 245-249

4 资捷, 宋平, 王莉平. NO 通过人精子顶体酶对顶体反应的影响. 中国男科学杂志 2006; 20(5): 42-43, 47

5 Auharek SA, Lara NL, Avelar GF, et al. Effects of inducible nitric oxide synthase (iNOS) def ciency in mice on Sertoli cell proliferation and perinatal testis development.Int J Androl2012; 35(5): 741-751

6 王江涛, 颜醒愚. NO 与精子及其获能关系的研究现状.中国男科学杂志 2011; 25(3): 68- 69

7 Lue YH , Hikim AP , Swerdloff RS,et al. Single exposure to heat induces stage-specific germ cell apoptosis in rats: role of intratesticular testosterone on stage specificity.Endocrinology1999; 140(4): 1709-1717

8 王莉, 李雅丽, 吴静. 诱导型一氧化氮合酶在宫颈癌组织表达及意义. 医药论坛杂志 2011; 32(21): 61-63

9 李启星, 魏小斌. 生精细胞凋亡与男性不育症. 海南医学2010; 21(22): 16-18

10 王力, 陈东, 闵泽, 等. 益精方对不育症大鼠睾丸生精细胞凋亡及Bcl-2、Bax蛋白表达的影响. 中国中西医结合杂志 2014; 34(5): 602-605

11 Lue Y, Sinha Hikim AP, Wang C,et al. Functional role of inducible nitric oxide synthase in the induction of male germ cell apoptosis, regulation of sperm number, and determination of testes size: evidence from null mutant mice.Endocrinology2003; 144(7):3092-3100

12 Ishikawa T, Kondo Y, Goda K,et al.Overexpression of endothelial nitric oxide synthase in transgenic mice accelerates testicular germ cell apoptosis induced by experimental cryptorchidism.J Androl2005; 26(2): 281-288

13 Wang C, Cui YG, Wang XH,et al. Transient scrotal hyperthermia and levonorgestrel enhance testosteroneinduced spermatogenesis suppression in men through increased germ cell apoptosis.J Clin Endocrinol Metab2007; 92(8): 3292-3304

14 Paul C, Teng S, Saunders PT. A single, mild, transient scrotal heat stress causes hypoxia and oxidative stress in mouse testes, which induces germ cell death.Biol Reprod2009; 80(5): 913-919

15 Valenti S, Cuttica CM, Fazzuoli L,et al. Biphasic effect of nitric oxide on testosterone and cyclic GMP production by purif ed rat Leydig cells cultured in vitro.Int J Androl1999; 22(5): 336-341

（2014-09-15收稿）

Effects of tribulus terrestris extract on the nos-no system of the thermal-injured testis in mice*

Tian Hongyan, Li Zhixin**, Xu Ye, Pan Xiaoyan,Wang Hongjun, Liu Zhongping, Lin Dongjing
Department of Histology and Embryology,Jilin Medical College,Jilin 132013,China

Li Zhixin, E-mail: lzx-62@163.com

ObjectiveTo investigate the effects of Tribulus Terrestris extract on the NOS-NO system of the thermalinjured testis in mice, and explore its mechanism.MethodsAll 30 healthy male mice were randomly divided into the control group, the model group and the treated group, 10 mice per group. The thermal-injured testis models of mice were established and then were administrated with dose of Tribulus terrestris extract. NOS activity and NO content of the testis were measured. Levels of testicular NOS and Caspase-3 were detected by immunohistochemistry. The content of testosterone in serum was detected by ELISA.ResultsCompared with that of the control group, activities of NOS and the content of NO in testicular tissues were increased signif cantly in the model group. The positive expression of iNOS and the number of testicular Caspase-3 positive cells were also increased obviously, but the serum concentration of testosterone was decreased. Compared with that of the model group, activities of NOS and the content of NO of the testicular tissue were decreased in the treated group. The positive expression of iNOS and the number of testicular Caspase-3 positive cells were also decreased signif cantly, but the serum concentration of testosterone was increased.ConclusionTribulus terrestris extract shows protect effects on the thermal-injuried testis in mice by regulating the NOS-NO system.

tribulus terrestris; thermal injuries; testis; nitric oxide synthase; nitric oxide

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.003

R 329.464; R 594.1

资助: 吉林省教育厅科学技术研究项目资助（2012484，2012485，2013477）;吉林省卫生厅科技计划资助项目（2012年）
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, E-mail: lzx-62@163.com