穿膜肽EGFP的构建及其对人成熟精子的穿膜活性鉴定*

陈厚仰仇克清孙 捷黄志辉应志伟吴丽萍曾 韩伍琼芳**

1. 江西省妇幼保健院辅助生殖中心（南昌 330006）; 2. 南昌大学第三附属医院

穿膜肽EGFP的构建及其对人成熟精子的穿膜活性鉴定*

陈厚仰1仇克清2孙 捷1黄志辉1应志伟1吴丽萍1曾 韩1伍琼芳1**

1. 江西省妇幼保健院辅助生殖中心（南昌 330006）; 2. 南昌大学第三附属医院

目的构建穿膜肽TAT与EGFP融合蛋白的原核表达系统，研究该融合蛋白对人成熟精子的穿膜作用和对精子运动参数的影响。方法以pEGFP-N1载体为模板，设计N端和C端含有TAT序列的引物，用PCR技术扩增TAT-EGFP和EGFP-TAT基因，扩增产物插入载体 pET28a，构建成重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFPTAT。将重组质粒转入大肠杆菌DE3中，IPTG 诱导TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白表达。表达产物经Ni-NTA亲和层析柱纯化后SDS-PAGE电泳鉴定。将融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分别加入正常人精子中孵育，荧光显微镜观察融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT穿膜情况。结果成功构建了高表达重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP-TAT，纯化了分子质量约为32 kD 的融合蛋白 TAT-EGFP和EGFP-TAT。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在正常人成熟精子中有穿膜作用。不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT对正常人成熟精子存活率及运动参数无明显影响。结论 通过对融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT表达纯化及活性分析，证实穿膜肽TAT在精子中的跨膜转运作用，为将来精子研究提供了实验基础。

细胞穿膜肽; 绿色荧光蛋白; 精子

近年来研究热点之一细胞穿膜肽（cell-penetrating peptides, CPPs），也称为蛋白质转导域 （protein translocation domain, PTD）或“特洛伊木马”肽（Trojan horse peptides）或转导肽 （transduction peptide）等，是一种高度阳离子短肽。穿膜肽具有强大的运载潜能[1]，可以通过化学结合或基因融合等方式携带各种生物大分子（蛋白质、多肽、DNA、化学小分子药物、反义核酸、肽核酸、纳米颗粒、荧光素、有机分子、腺病毒载体、成像物质、脂质体及铁颗粒等），运载能力可以达到120 kDa（如半乳糖苷酶）、40 nm（如铁颗粒），其对宿主细胞无显著毒副作用。穿膜肽TAT是1988年被Green[2]发现并证实的具穿膜功能的多肽分子，来源于人免疫缺陷病毒（HIV-1）的反式激活蛋白，是其中被称为蛋白转导域的一段特殊氨基酸序列（49～57位氨基酸）（RKKRRQRRR），它是最经典的CPPs。然而，利用穿膜肽携带目标蛋白进行精子功能的研究仍未见报道。由于成熟精子特殊的结构，有必要证实穿膜肽携带目标蛋白进入精子内的有效性，为有关功能研究提供依据。穿膜肽能否成功作为一种适用范围广、生物毒性小且转运效率高的理想载体，我们把增强型绿色荧光蛋白（enhanced green f uorescent protein，EGFP）作为报告蛋白，通过构建TAT与EGFP的融合表达载体，表达和纯化穿膜肽EGFP融合蛋白后与正常人成熟精子孵育，观察其穿膜效率以及对精子的存活率及各项运动参数的变化，为研究人成熟精子寻找新的途径。

材料与方法

一、材料

（一）质粒、菌株和细胞

质粒pEGFP-N1（clontech）、pET28a（novegen）、菌株E.coli感受态细胞TOP10、BL21(DE3)均为本实验室保存。

（二）主要试剂和仪器

HTF培养基（Millipore），EGFP（Biovision），BamHI、NdeI、XhoI等限制性内切酶（Fermentas），Taq DNA聚合酶、Pfu DNA聚合酶（上海依祥），胰化蛋白胨、酵母提取物（OXOID公司），质粒及胶回收试剂盒（Axygen公司），Ni-NTA亲和层析柱（GE 公司），DMSO、BSA等（Sigma公司），DNA Ladder（北京天根），伊红染色试剂盒（安徽安科），引物合成及测序（上海生工），凝胶成像分析仪（BioRaid），激光共聚焦显微镜（OLYMPUS公司），台式高速冷冻离心机（Eppendorf），PCR仪（ABI2720），酶标仪（Biorad），荧光显微镜（OLYMPUS公司）。

（三）精液标本的收集和检测

由我院辅助生殖中心收集，与患者沟通同意后签署知情同意书。CASA分析符合 WHO（第五版）规定的正常标准。

二、方法

（一）重组质粒 pET28a-TAT-EGFP和 pET28a-EGFP-TAT的构建

构建pET28a-TAT-EGFP重组质粒：根据EGFP 基因序列和载体pET28的特性，设计引物EGFPN上游5'端分别加入了保护碱基GGG、NdeI酶切位点（CATATG）、TAT 序列和BamHI酶切位点（GGATCC）（引物设计序列详见表1），以pEGFP-N1载体为模板，加入引物EGFPN引物，PCR特异性扩增出TAT-EGFP片段。扩增体系为25μL体系，扩增步骤为：95℃5min预变性；95℃ 30s，58℃30s，72℃1.5min，25循环；72℃7min延伸。产物在1.2%的琼脂糖凝胶电泳，切胶回收后进行NdeI和XhoI双酶切，跑胶、切胶回收得到小片段TATEGFP。同时将载体pET28a进行同样条件下的双酶切。将酶切后的TAT-EGFP与线性载体pET28a用T4 连接酶连接，将连接产物转化入感受态细胞TOP10，挑选阳性克隆培养并行菌落PCR和测序，鉴定插入的TAT-EGFP片段序列无误后,提取质粒，-70℃保存。

表1 引物设计序列

构建pET28a-EGFP-TAT重组质粒：设计引物EGFPC下游5'端加入了保护碱基CCG 、XhoI酶切位点（CTCGAG）、TAT序列和BamHI酶切位点（GGATCC），参照构建pET28a-TAT-EGFP重组质粒方案构建pET28a-EGFP-TAT重组质粒。

（二）TAT-EGFP和EGFP-TAT在大肠杆菌中的表达及纯化

将重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT转化菌株E.coli感受态细胞BL21（DE3）中，培养后涂布于含有卡那霉素的LB平皿中，37℃倒置培养过夜。挑取单菌落至4 ml LB 培养液中放大培养，细菌菌浓度至OD600=0.6左右时，加入IPTG诱导，终浓度为0.5mM（同时留一管不诱导作为对照），收集菌液后使用超声裂菌，待细菌沉淀变澄清，13000rpm，4℃，离心30min，收集上清用Ni-NTA亲和层析柱纯化，250 mmol/L咪唑洗脱结合于柱上的蛋白，收集蛋白峰用PBS透析后，纯化产物进行SDSPAGE电泳分析。以牛血清白蛋白为标准品，通过分光光度计测OD595读数与蛋白浓度的标准曲线，求得制备纯化蛋白的浓度。

（三）融合蛋白的穿细胞膜作用

收集正常人成熟精子，离心，用PBS重悬，洗涤3次，最后用HTF液重悬沉淀。将融合蛋白TAT-EGFP和EGFP -TAT纯化后无菌过滤，调整浓度为1μmol/L、5μmol/L，加入已处理好的正常人成熟精子中，设空白、EGFP对照，放入CO2培养箱中孵育1h和2h，取出后PBS清洗3次，置于荧光显微镜下观察。

（四）融合蛋白对精子存活率及各项运动参数的影响

加入TAT-EGFP和EGFP-TAT使终浓度分别为1μmol/L和5μmol/L，设置空白、EGFP对照，放入CO2培养箱中孵育2h。按照伊红染色试剂盒说明书检测加入融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT后对精子存活率的影响，同时利用CASA检测加入融合蛋白TATEGFP和EGFP-TAT后精子运动参数的变化情况。

三、统计学分析

结 果

一、重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT的鉴定

PCR扩增出约为776bp片断，与预期结果相符，跑胶、切胶回收备用（见图1A）。将回收的扩增片段和pET28a载体行NdeI和XhoI双酶切，跑胶、切胶回收（见图1B）。在连接酶作用下，将经NdeI和XhoI双酶切后的线性化pET28a质粒和扩增片段连接，并转化TOP10感受态细菌，挑取平板上阳性单菌落、摇菌后行菌液PCR（见图2A）。阳性克隆提取质粒测序证实所插入基因片段无突变，与GenBank中序列一致（见图2B）。结果证实重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP –TAT构建成功。

图1 分子克隆构建重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT

图2 阳性克隆菌液PCR和测序验证

二、融合蛋白TAT-EGFP和EGFP -TAT的表达、纯化与鉴定

选取高表达的阳性克隆子大量表达融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT，SDS-PAGE电泳检测目的蛋白，在相对分子质量约为32kD左右出现一条强表达带，符合预期分子质量大小（见图3A）。用Ni-NTA亲和层析柱纯化融合蛋白TAT-EGFP和 EGFP-TAT，取样品跑SDS-PAGE（见图3B），通过ImageJ图像分析软件分析，其纯度（93.2± 3.5）%。根据牛血清白蛋白制备标准曲线，求得标准曲线回归方程为Y=0.0226X+0.0194，根据纯化蛋白溶液测得的平均吸光度值计算出纯化TATEGFP浓度为（0.35±0.03）mg/mL，EGFP-TAT为（0.42±0.04）mg/mL。

图3 融合蛋白SDS-PAGE鉴定

三、蛋白穿细胞膜作用的检测

不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT分别加入精子中，孵育1h和2h，在荧光显微镜下观察到精子呈现出清晰明亮的绿色荧光蛋白，孵育时间越长，荧光越强；而EGFP对照组和空白对照组精子中未见荧光（见图4）。不同浓度组内和组间比较差异无统计学意义，不同孵育时间组内和组间比较差异也无统计学意义（见表2），即浓度越高，穿膜效率无明显增强，孵育时间越长并未增加穿膜效率。

图4 不同浓度融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT与精子孵育不同时间的穿膜效果图

表2 不同浓度的融合蛋白与正常精子孵育不同时间穿膜效率的比较（±s，%）

表2 不同浓度的融合蛋白与正常精子孵育不同时间穿膜效率的比较（±s，%）

孵育 TAT-EGFP(μmol/L) EGFP-TAT (μmol/L)时间(h) 1 5 1 5 1 60.88±3.59 65.27±4.63 59.95±2.57 63.12±5.67 2 63.69±5.58 66.40±3.58 63.38±4.60 65.15±3.63

四、融合蛋白对精子存活率及各项运动参数的影响检测

不同浓度的融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT与正常人成熟精子作用2h后精子存活率和运动各项参数比较差异无统计学意义（见表3）。融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT在一定范围浓度里对正常人成熟精子无明显影响。

讨 论

EGFP 是绿色荧光蛋白（green fluorescent protein，GFP）的一种优化突变体，在480 nm波长的激发下EGFP可发射出比GFP亮35倍的绿色荧光，与其他蛋白的融合并不影响其发光，而且不需要任何外源性底物和辅助因子，具有无毒、稳定、无污染等优良的物理特性，已作为报告分子广泛地应用于分子生物学研究[3]。在多数细胞中，EGFP 荧光均匀的充满胞浆、细胞核，在荧光显微镜下可直接观察。本研究以EGFP为报告基因，成功构建了重组质粒pET28a-TAT-EGFP和pET28a-EGFP -TAT，通过转化到菌株E.coli感受态细胞BL21(DE3)中表达、提取得到TATEGFP和EGFP-TAT融合蛋白。纯化后的TAT-EGFP和EGFP-TAT融合蛋白进行 SDS-PAGE蛋白电泳分析，表达的蛋白分子质量约为32kD，与预期分子质量大小一致。

精子功能正常与否，对临床选择体外受精（in vitro fertilization，IVF）治疗不育症极为重要。常规IVF需要功能完全正常的精子才能受精。临床研究表明 IVF受精失败的患者主要与精子功能障碍有关。目前国内外对成熟精子的功能研究主要包括：精子获能[4]、顶体反应[5]、穿透能力及体外受精能力[6]等。精子获能后精子高度活跃运动才具备发生顶体反应的潜能，在 IVF 或体内自然受精过程中，精子的顶体反应是在结合到透明带上，由透明带糖蛋白受体诱发的。精子不完全同于一般细胞，是一种特化细胞。TAT已经在肿瘤[7]、糖尿病[8]、免疫治疗[9]等临床领域展现出很大的研究价值，能搭载不同物质进入不同细胞，比如巨噬细胞[10]、神经元细胞[11]、成纤维细胞[12]，但在人精子方面的研究目前鲜有报道。

本研究设计引物成功表达N端和C端含有TAT的EGFP重组蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT，分别与正常人成熟精子孵育后，荧光显微镜下观察到精子内呈现出清晰明亮的绿色荧光，证实TAT能顺利携带EGFP进入精子，这两种融合蛋白均能进入精子中穿膜效率无明显差异。EGFP作为对照组未发现穿细胞膜效应。通过伊红染色检测精子的存活率，结果显示添加融合蛋白TAT-EGFP和EGFP-TAT前后精子存活率无明显变化；同时利用CASA检测精子运动各项参数，结果表明在一定浓度范围融合蛋白对精子存活率和各项运动参数无明显影响。我们研究结果初步证实穿膜肽TAT在精子中可达到满意的穿膜效果而且无明显毒性作用，这为穿膜肽在精子方面的研究提供了实验基础。

表3 不同浓度融合蛋白与正常人成熟精子作用后各项运动参数检测结果（±s）

表3 不同浓度融合蛋白与正常人成熟精子作用后各项运动参数检测结果（±s）

注: PR为前向运动; VSL为直线速率; VCL为曲线速率

组别 例数(n) 孵育浓度(μmol/L) 存活率(%) 总活力(%) PR(%) VSL(μm/s) VCL (μm/s) TAT- EGFP 16 1 80.81±6.13 75.04±4.05 50.30±3.18 10.63±0.77 24.76±1.23 5 76.69±4.85 74.25±4.88 49.85±3.09 10.54±0.76 24.54±1.20 EGFP- TAT 16 1 77.50±4.03 74.62±3.03 50.06±3.18 10.56±0.77 24.60±1.20 5 78.44±5.91 71.42±3.93 50.28±3.18 10.69±0.75 24.80±1.22 EGFP 16 5 79.31±5.10 75.08±5.06 50.20±3.18 10.65±0.76 24.78±1.22空白 16 0 73.69±3.12 74.90±4.12 50.17±3.20 10.60±0.76 24.72±1.23

1 Wang F, Wang Y, Zhang X,et al. Recent progress of cellpenetrating peptides as new carriers for intracellular cargo delivery.J Control Release2014; 174: 126-136

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（2014-09-17收稿）

Construction of CPPs EGFP and verif cation of its transmembrane activity into human mature sperm*

Chen Houyang1, Qiu Keqing2, Sun Jie1, Huang Zhihui1, Ying Zhiwei1, Wu Liping1, Zeng Han1, Wu Qiongfang1**1. Reproductive Medical Center, Jiangxi Provincial Maternal and Child Health Hospital, Nanchang 330006, Jiangxi, China;
2. The Third Aff liated Hospital of Nanchang University

Wu Qiongfang, E-mail: wuqiongfang898@sina.com

ObjectiveTo construct an prokaryotic expression system of cell-penptrating peptides（TAT）-enhanced green f uorescent protein fusion protein,and investigate its transmembrane effect on human mature sperm and the inf uence of sperm motility parametersin vitro.MethodsUsing pEGFP-N1 carrier as a template, the primers that contained TAT sequence of N-terminal and C-terminal respectively were designed. TAT-EGFP and EGFP-TAT gene were amplified by PCR,and its products were inserted into pET28a vector to construct recombinant plasmids pET28a-TAT-EGFP and pET28a-EGFP-TAT. The recombinant vectors were transformed into E.coli DE3.The fusion protein TAT-EGFP and EGFPTAT were induced by IPTG. The expressed fusion proteins were purif ed by Ni-NTA aff nity chromatography column and identif ed by SDS-PAGE electrophoresis. fusion proteins were added into human sperm in vitro toobserve transmembrane effect on human mature sperm.ResultsThe high expression pET28a-TAT-EGFP and pET28a-EGFP-TAT recombinant vectors were constructed successfully. The fusion protein TAT-EGFP and EGFP-TAT were purif ed,which molecular mass were approximately 32 kD. The fusion proteins showed transmembrane effect on human sperm. Different concentrations of the fusion proteins have no obvious inf uence on the survival rate and motion parameters of sperm.ConclusionThe transmembrane effect were conf rmed by the purif cation and activity analysis of the fusion protein TAT-EGFP and EGFPTAT,which provided a experimental basis for applying CPPs to human sperm．

cell-penetrating peptides; green f uorescent proteins; spermatozoa

10.3969/j.issn.1008-0848.2014.11.002

R 321.1

资助: 江西省卫生计生委普通科技计划资助课题（20151119）
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, E-mail: wuqiongfang898@sina.com