结直肠癌病人肠道黏膜菌群结构的变化

李毅，王骥平，李宇，曹守根，姚增武，周岩冰

(1 青岛大学附属医院普外科，山东 青岛 266003； 2 青岛市市立医院东院急诊外科； 3 烟台市烟台山医院)

人体胃肠道蕴藏着一个复杂而丰富的微生物群落，在结肠中含有高达1013～1014的微生物[1]。这些微生物对宿主的营养和黏膜免疫方面有至关重要的作用，如代谢某些食物和药物成分、调节人体免疫应答、抵御外来病源侵害，等等[2-3]。已知胃癌和宫颈癌分别由幽门螺旋杆菌和人类乳头状瘤病毒所导致[4-5]。随着第二代测序技术的发展，许多研究显示，肠道菌群在结直肠癌(CRC)的发展中起到重要作用[6]。本研究采用第二代高通量焦磷酸测序技术，分析 CRC病人肠道菌群结构的变化，探讨CRC诊断与治疗的新方法。

1 资料与方法

1.1 一般资料

我院住院的CRC病人50例，男25例，女25例；年龄41～80岁；体质量指数19.7～28.6。病人既往无结直肠手术史；无慢性肠道疾病、代谢性疾病、感染性疾病；术前未行放化疗治疗；手术前3个月内没有应用糖皮质激素、抗生素以及其他的非甾体抗炎药物。手术标本在进行病理组织学检查后按TNM分期进行分类。癌组织和癌旁正常组织(距癌组织8～10 cm)在手术期间收集。所有标本立即用液氮快速冰冻然后储存在-80 ℃冰箱内。病人均知情同意。

1.2 细菌DNA提取

粪便细菌基因组DNA通过DNA提取试剂盒QIAamp DNA Mini Kit(德国Qiagen公司生产)进行提取。将样品中加入酶裂解缓冲液、溶菌酶和消色肽酶，并在37 ℃下反应1 h。然后，加入蛋白酶K和裂解缓冲液AL，并将悬浮液置于56 ℃下反应30 min。最后，将基因组DNA通过核酸纯化柱进行纯化并洗脱。所提取的基因组DNA的浓度通过量子比特荧光计(美国Invitrogen公司生产)测定，DNA的质量通过琼脂糖凝胶电泳测定。提取的基因组DNA储存在-20 ℃冰箱中。DNA提取均由中国深圳华大基因研究院专业人士完成。

1.3 PCR扩增和测序

使用通用引物(907F5′-CCGTCAATTCMTTT-GAGTTT-3′，338R5′ACTCCTACGGGAGGCAGCAG-3′)进行细菌的16S rDNA序列的V3-V5区域的PCR扩增。参数如下：95 ℃预变性2 min；然后95 ℃变性30 s， 55 ℃退火30 s， 72 ℃延伸30 s，共25个循环；最后72 ℃延伸7 min。焦磷酸测序使用GS FLX Titanium XLR70测序试剂盒，在454高通量测序平台(罗氏)上进行测序，测序工作由中国深圳华大基因研究院完成。

1.4 生物学分析

首先将测序得到的原始序列进行非冗余处理，然后将非冗余的序列进行物种注释并聚类成操作分类单元(OTU)，然后通过OTU注释完成物种的分类。使用Mothur(V.1.31.2，http://www.mothur.org/)软件将样品独特序列与RDP数据库(http://www.mothur.org/wiki/RDP_reference_files)比对，进行物种注释，一个OTU中包含的独特序列51%以上都注释为同一物种，则该OTU即注释为该物种，达不到51%的标准，则在上一个物种分类等级再进行OTU对应物种分析，得到该样品的物种组成信息，然后将每个OTU内所含的独特序列数进行统计，结合物种组成信息结果，得到每个物种在该样品中的丰度。

1.5 统计学分析

采用SPSS 18.0软件进行统计处理。两组样本数据间比较采用Mann-Whitney检验，以P<0.05为差异有显著性。

2 结 果

2.1 序列多样性分析

本文100个样本共得到1 032 723条高质量序列，平均每个样本含10 327条序列；在97%相似度水平上共得到12 115个OUT，平均每个样本含121个OUT。在当前测序深度下，稀疏曲线和Shannon指数几乎趋于稳定，表明大部分物种和多样性已经被检测到。

2.2 两种组织菌群结构在门水平上的比较

癌组织和癌旁正常组织中优势菌门相同，均为厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门和放线菌门。在CRC的癌组织中，厚壁菌门、拟杆菌门、变形菌门、梭杆菌门和放线菌门分别占35.34%、33.84%、14.79%、13.62%和0.94%；在癌旁正常组织中分别占37.53%、39.96%、15.27%、2.30%和2.51%。癌组织中梭杆菌门明显高于癌旁正常组织(Z=3.63，P<0.001)。

2.3 两种组织菌群结构在属水平上的比较

在属水平上，测序结果显示癌组织有172个属，癌旁正常组织有159个属，拟杆菌属在两组中均为丰度最高的菌属，分别占22.38%和21.25%，但两组间比较差异无统计学意义。存在显著性差异的菌属为梭杆菌属、弯曲菌属、Faecalibacterium和罗氏菌属，在癌组织中分别占12.08%、0.02%、1.94%和0.46%；在癌旁正常组织中分别占1.96%、0.01%、6.14%和2.42%。梭杆菌属、弯曲菌属在癌组织中的丰度与癌旁正常组织相比明显降低，而Faecalibacterium、罗氏菌属丰度明显升高，差异有显著意义(Z=1.84～3.63,P<0.05)。

3 讨 论

肠道菌群对于维持宿主肠道乃至全身的正常代谢功能和健康状态具有非常重要的意义[7-8]。本研究应用454焦磷酸测序技术检测了CRC病人癌组织和癌旁正常组织菌群结构的变化，结果显示，癌组织菌群结构较周围正常组织发生了明显改变，出现了有害的条件致病菌增加、有益的细菌减少的结构失调现象。

肠道炎症一直被称为肠癌的危险因素[9]。而在本项研究中梭杆菌属和弯曲菌属在癌组织中明显增多。梭杆菌属是一种具有侵入性和促炎的革兰阴性厌氧菌，而大量研究也表明，梭杆菌参与了炎症性肠疾病的发展[10]；弯曲菌属中被研究最多的是空肠弯曲菌，是目前公认的急性腹泻和胃肠炎的主要病原菌[11]。因此，梭杆菌属和弯曲菌属可能通过引起肠道炎症导致肠道微环境发生改变，促进肿瘤发生，但其促癌的具体机制还需要进一步研究。

Faecalibacterium和罗氏菌属均为丁酸产生菌，通常被认为是益生菌微生物[12]。因为丁酸盐可以通过保护肠道上皮细胞的完整性、调节肠道免疫应答、抑制肿瘤细胞生长、降低促致癌酶的活性等机制，从而能够保护宿主肠壁，降低肠道炎症及CRC发生的风险[13]。因此，这些有益细菌的减少可能是导致CRC发生的间接原因。

综上所述，本研究通过焦磷酸测序技术研究了CRC病人肠道菌群的相关变化，结果出现了有害的条件致病菌增加、有益细菌减少的结构失调现象，这为CRC的诊断和治疗提供了新思路。然而，肠道菌群变化促癌的确切机制仍不清楚，因此需要更多的研究以探讨CRC发生肠道菌群失调的机制。

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