尿沉渣2种miRNA检测在膀胱癌诊断中的应用价值

阎家骏 沈翀 孙泽宇 任煜 周毅 李俊龙 唐桂良 潘建刚 潘寿华徐国强

尿沉渣2种miRNA检测在膀胱癌诊断中的应用价值

阎家骏 沈翀 孙泽宇 任煜 周毅 李俊龙 唐桂良 潘建刚 潘寿华徐国强

目的 研究膀胱癌患者尿沉渣中miR-142-3p和miR-145-5p差异性表达，为临床寻找早期膀胱癌肿瘤标志物提供依据。 方法 搜集51例未接受经尿道肿瘤切除术的早期膀胱癌患者和38例健康对照者的清晨中后段尿液，从尿沉渣中提取RNA，采用miRNA特异性茎环逆转录荧光定量PCR检测目标miRNA表达水平，分析两组的受试者工作曲线（ROC），比较miR-142-3p和miR-145-5p及其组合在膀胱癌早期诊断中的价值。 结果 miRNA-142-3p在早期膀胱癌患者尿沉渣中显著升高（FC=3．93，P=0．0002，AUC=0．736）。组合测定miR-145-5p/miR-142-3p比值在膀胱癌患者与健康对照者间有统计学差异（P=0．00004，AUC=0．755）。 结论 测定尿沉渣中的miR-142-3p能有效发现早期膀胱癌，而检测miR-145-5p/miR-142-3p比值的诊断价值更高。

miRNA 膀胱癌 肿瘤标志物

膀胱癌是国内人群泌尿系统最常见的恶性肿瘤，早期诊断和治疗对改善膀胱癌患者的预后，提高总生存率至关重要。膀胱镜是目前常用的膀胱癌检查手段，作为有创检查，患者较难接受[1]。近年来医学界开始探索将尿液肿瘤标志物测定用于早期膀胱癌检测。在众多肿瘤标志物中，微小RNA（miRNA）类标志物在肿瘤诊断、治疗及预后判断中的意义已备受基础研究学者与临床医师的关注[2-3]。由于尿沉渣中含有膀胱内壁脱落细胞，是特异性检测膀胱上皮肿瘤的理想来源，已有研究显示尿沉渣中差异表达的miR-142-3p以及miR-145-5p有望成为新型的膀胱癌肿瘤标志物[4-5]。本研究利用miRNA特异性茎环逆转录荧光定量PCR（qPCR）方法测定膀胱癌患者和健康对照者尿沉渣中miR-142-3p和miR-145-5p的表达差异，探讨其作为早期膀胱癌诊断标志物的价值。

1 资料和方法

1.1 一般资料 收集绍兴市人民医院泌尿外科2013-01—2014-04住院的51例膀胱癌患者的清晨新鲜尿样，所有患者均未接受经尿道肿瘤切除术（TURBT）且未经过放疗及化疗，其中男40例，女11例，年龄32～82岁，平均（63.85±13.84）岁。病理分期根据美国癌症联合委员会（AJCC）TNM分期标准确定，T1期40例，T2期4例，T3期7例。以同期在绍兴市人民医院健康检查的38例健康体检者作为对照，其中男22例，女16例，年龄28～75岁，平均（54.87±18.94）岁；均接受影像学检查确认，排除膀胱占位性病变。研究方案通过绍兴市人民医院伦理审查委员会批准，在样本采集前均征得研究对象同意。

1.2 主要试剂及仪器 检测反应于CFX96 qPCR（Bio-Rad）系统中进行，按mirVana试剂盒说明书提取RNA，利用ND-1000分光光度计测定总RNA浓度。反转录酶（RT）M-MLV购自美国Promega公司，特异性茎环逆转录引物及qPCR检测引物购自广州市锐博生物科技有限公司，内参U6引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，随机引物、荧光定量SYBR Green Mix、dNTP以及重组RNase抑制剂（RRI）购自日本TaKaRa公司。

1.3 方法

1.3.1 标本搜集和制备 每例研究对象留取清晨中后段尿液50ml，4℃下500g/min离心10min分离尿沉渣，500μl磷酸盐缓冲液清洗2次后按mirVana试剂盒说明书提取RNA，RNA提取物在使用前均于-80℃储存。

1.3.2 miRNA的cDNA合成 将30μl RNA与1μl随机引物、4μl miRNA特异性茎环逆转录混合引物混合，70℃下孵育10min随即用冰水冷却。冷却后加入1μl 10 mM dNTP、10μl RT缓冲液、1μl RRI、1μl M-MLV和2μl RNase-free水，42℃下逆转录反应60min，70℃下反应10min。

1.3.3 miRNA的荧光定量PCR检测 在八联管中加入2μl cDNA、5μl SYBR Green Mix、1μl目标miRNA特异性上、下游检测引物和1μl水组成10μl反应体系。qPCR反应过程如下：95℃30s，95℃5s，60℃20s，72℃10s共40个循环，熔解温度70～90℃，熔解率1℃/5s。对每个检测目标设定相同的循环阈值（Ct）基线和截点，每份样品检测3次。以内参RNA U6为miRNA定量参照，2-ΔΔCt法计算各目标miRNA组间变化倍数。

1.4 统计学处理 针对数据非正态分布特性，利用R语言（v3.0.2）环境中Mann-Whitney U检验对结果进行分析。受试者工作曲线（ROC）分析于MedCalc软件中完成。

2 结果

51例膀胱肿瘤患者均接受经TURBT，术后病理诊断为膀胱尿路上皮癌。其中T1期40例，T2期4例，T3期7例，所有患者均未发现淋巴结和远处转移。38位健康对照者经诊断均无泌尿系统疾病。

以U6为内参，miRNA特异性茎环逆转录qPCR检测表明膀胱癌患者尿沉渣中的miR-142-3p的表达水平远高于健康对照者（倍性变化FC=3.93，P=0.0002），而膀胱癌患者的miR-145-5p相比健康对照者有低表达倾向，但尚无统计学差异（FC=0.59，P=0.056）。

尽管miR-145-5p对于膀胱癌患者的筛查统计置信度不足，但其与miR-142-3p相反的表达趋势表明它与miR-142-3p有望组合出具有诊断价值的联合肿瘤标志物。结果显示，膀胱癌患者miR-145-5p/miR-142-3p比值远低于健康对照者（FC=0.15，P=0.00004）。

由ROC曲线分析2种miRNA及其组合的诊断能力数据如图1所示。若单独测定miR-142-3p，得出曲线下面积（AUC）为0.736。设ΔCt[（miR-142-3p-U6）]截点≤12.5，该标记检测早期膀胱癌的灵敏度为68.63%、特异度76.32%，而miR-145-5p/miR-142-3p的AUC提升至0.755，设ΔCt[（miR-145-5p）/（miR-142-3p）]-U6截点≥0.664，灵敏度较低（66.67%）但特异度较高（86.84%），详见图2，2种标志物及其组合的AUC诊断数据见表1。

3 讨论

迄今为止，膀胱镜检查是膀胱癌诊断和随访监测的金标准，但由于其属于有创性检查，患者依从性较差，而且对早期肿瘤诊断困难，所以在临床上开展受到了一定限制。近年来，尿液的膀胱癌肿瘤标志物的检测作为内镜检查的替代或辅助手段已在临床泌尿外科领域掀起热潮。然而，目前美国食品与药物管理局（USFDA）批准的生物标记物包括膀胱肿瘤抗原（BTA）stat、Trak、核基质蛋白22（NMP22）、尿纤维蛋白原降解产物（FDP）和UroVysion荧光原位杂交技术目前尚无法在临床广泛应用[6-7]，原因是以上生物标志物和检测方法都不够灵敏和稳定，无法取代传统检测方法[6，8-9]。医学界仍在探索新的肿瘤标志物用于膀胱癌的诊断和监测。

图1 3种miRNA指标检测早期膀胱癌的ROC曲线

图2 膀胱癌患者（虚线）及健康对照者（实线）尿液沉渣中3种miRNA指标的ΔCt值

表1 miRNA指标AUC分析数据

miRNA是目前肿瘤生物标志物研究的热点，作为一类内源的、非编码调控的单链RNA，miRNA主要参与转录后基因表达调控，对细胞发育、增殖、变异和死亡有重要影响。已有研究发现，多种miRNA具有致癌基因和抑癌基因的作用。此前有研究发现miRNA的异常表达与膀胱癌发病和进展的关系密切[10-12]。与mRNA相比，miRNA具有结构稳定，耐受恶劣的物理化学条件（如不同pH值、RNase活性）的特点[13]。尿沉渣中的miRNA具有抗降解性，可在室温下长期储存甚至可以耐受多次冻融[5]，这些特性使得尿沉渣中的miRNA成为膀胱癌早期诊断标志物的研究新方向。

目前研究显示尿沉渣miR-142-3p可以作为潜在的膀胱癌新标志物[4]。而miR-145在膀胱癌中表达下调，同时能抑制膀胱癌细胞增殖、转移和侵袭[14-16]，但尚不明确尿沉渣中的miR-145能否用于膀胱癌诊断。

与既往研究比较[4]，本研究中膀胱癌患者尿沉渣中的miR-142-3p含量远高于健康对照者。也有研究指出miR-142在白血病及睾丸癌中也有高表达[17]。此外，miR-142的高表达被视作肺癌诊断标记[18]。但有学者对睾丸癌和结肠癌的研究则证明miR-142既可能作为致癌基因，也可能作为抑癌基因[19-20]，而目前对其在膀胱癌发病机制中起的作用尚不明确。

miR-145在膀胱癌发病过程中则充当抑癌基因的角色。研究显示miR-145通过抑制癌基因细胞因子信号传导抑制蛋白7（SOCS7）、纤维束蛋白同源物1（FSCN1）和纤溶酶原激活物抑制因子1（PAI-1)防止膀胱癌细胞生长和侵袭[15-16，21]。此外，miR-145能够激活核心结合因子（CBFB）、神经钙调蛋白磷酸酶（PPP3CA）和网格蛋白交互子1（CLINT1）从而促使膀胱癌细胞凋亡[14]。尽管既往研究提示尿沉渣中的miR-145-5p有望成为膀胱癌肿瘤标志物[4-5]，但在本研究中发现膀胱癌患者miR-145-5p的表达与健康对照者无统计学差异。进一步研究发现miR-145-5p/miR-142-3p的表达比值对膀胱癌具有潜在的诊断价值，这在既往研究中尚是首次。

本研究旨在评估新型miRNA标志物对于早期膀胱癌的诊断效能，所以只包含了无淋巴结转移或远处转移的患者（以T1期患者为主）。进一步调查研究目标应针对来自多家不同医疗机构的各类疑似膀胱癌患者，并评估这些miRNA的诊断性能，将来也会研究这些标志物在其他类型样本，如尿液上清液、血清或血浆中的用途。

综上所述，本研究发现提取自尿沉渣的miR-142-3p能有效发现早期膀胱癌，而miR-145-5p/miR-142-3p组合检测能提升miR-142-3p的诊断性能，希望将来这些miRNA测定能应用于日常的膀胱癌筛查和膀胱癌复发监测。

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miR-142-3p and miR-145-5p in urine sediment as potential markers for bladder cancer

Objective To investigate the contents of miR-142-3p and miR-145-5p in urine sediment of patients with bladder cancer．Methods Morning mid-stream urine samples were collected from 51 patients with early stage bladder cancer before transurethral resection and 38 healthy controls．RNAs were extracted from urine sediment and targeting miRNAs were quantified by stem-loop qPCR．The area under receiver operating characteristic curve(AUC-ROC)was used to assess the diagnostic value of miRNAs for bladder cancer． Results miR-142-3p in urine sediment was significantly elevated in urinary sediment of bladder cancer patients（FC=3．93,P=0．0002,AUC=0．736）,while the miR-145-5p had a trend of reduction（FC=0．59,P=0．056）．The ratio of miR-145-5p/miR-142-3p was significantly lower in early bladder cancer patients than that in healthy controls（FC=0．15,P=0．00004,AUC=0．755）．Conclusion MiR-142-3p in urine sediment is increased in patients with early bladder cancer,and the ratio of miR-145-5p/miR-142-3p may be used for early detection of bladder cancer．

MiRNA Bladder cancer Tumor biomarker

浙江省科技厅公益技术应用研究计划项目（2012C33SA600020）

312000 绍兴市人民医院、浙江大学绍兴医院、绍兴文理学院附属第一医院泌尿外科（阎家骏、沈翀、任煜、周毅、李俊龙、唐桂良、潘建刚、潘寿华、徐国强）；浙江大学浙江加州国际纳米技术研究院（孙泽宇）

阎家骏，E-mail:amyyjj001@163.com