响应面法优化马奶酒发酵条件的研究

2014-04-12李小溪古丽娜孜张晨璐段莉薇阎晓菲

中国酿造 2014年2期

王璐，李小溪，古丽娜孜，张晨璐，张艺，段莉薇，阎晓菲，武运*

（1.新疆农业大学食品科学与药学学院，新疆乌鲁木齐 830052；2.新疆农业大学科学技术学院，新疆乌鲁木齐 830052）

马奶是新疆少数民族饮食文化中的瑰宝，至今仍保留着马奶酒的传统制作方法。马奶的营养价值很高，含有丰富的蛋白质、乳糖、维生素和矿物质，并含有人体不可缺少的氨基酸和脂肪酸[1]。草原鲜马奶杂质少，用其酿出的马奶酒所含甲醇、异丁醇、异戊醇成分极低，铅、汞等重金属含量低于国家标准的10%，甲醛的含量更是少之又少。此外，马奶酒的营养价值也很高，氨基酸的总量比新鲜马奶高约51%[2-4]。

目前，有部分关于奶酒发酵条件优化的研究[5-8]，但采用响应面法优化马奶酒发酵条件的文章较少，针对以上现状，为充分开发利用新疆马奶资源，提高马奶综合经济效益，本试验主要以新疆乌鲁木齐南山地区新鲜马奶为原料，通过单因素试验确定马奶酒发酵工艺，采用响应面法优化马奶酒发酵条件的最佳参数，为新疆新鲜马奶的工业化生产和利用提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜马奶：新疆乌鲁木齐南山地区。

乳酸菌、酵母菌：新疆农业大学食品科学与药学学院微生物实验室。

MRS培养基：葡萄糖20g，蛋白胨10g，牛肉膏10g，酵母膏5g，柠檬酸二胺2g，磷酸氢二钾2g，乙酸钠5g，硫酸镁0.58g，硫酸锰0.25g，吐温-80 1mL，蒸馏水1000mL。

酵母浸出粉胨葡萄糖培养基（yeast extract peptone dextrose medium，YPD）：酵母膏10g，蛋白胨20g，葡萄糖20g，蒸馏水1000mL。

1.2 仪器与设备

MST-401 JM10002型电子秤：上海民桥精密科学仪器有限公司；LD2X-50KB型立式电热压力蒸汽灭菌器：上海申安医疗器厂；DZKW-172电热恒温水浴锅：北京市光明医疗仪器厂；CH2176J微电脑电磁炉：中山市格兰仕生活电器制造有限公司；SXKW数显控温电热套：北京市永光明医疗仪器厂；HR40-ⅡA2生物安全柜：青岛海尔特种电器有限公司；WFI-J型手持测糖仪：成都豪创光电仪器有限公司。

1.3 试验方法

1.3.1 马奶酒加工工艺流程

新鲜马奶→过滤→杀菌→冷却→接种乳酸菌和酵母菌→酒精发酵→灌装→成品

1.3.2 分析测定方法

酒精度测定：用酒精计进行测定；酸度测定：用酸碱滴定法进行测定；还原糖测定：用糖度计进行测定。理化、卫生指标测定：参考GB/T 23546—2009《奶酒》[9]。

感官指标：采用综合评分法，在有明亮自然光、温度为25℃的房间内进行马奶酒感官评定。感官评分标准（满分100分）见表1。

表1 马奶酒感官评分标准Table 1 Sensory evaluation criteria of Kumiss

1.3.3 操作要点

（1）马奶的预处理

原料奶需无添加剂、无异味的新鲜马奶，用4层纱布过滤将马奶中的杂质和异物除去。再将马奶加热至90～95℃，保持30s杀菌，放置冷却至室温，待发酵用。

（2）种子发酵液及母发酵液的制备

种子发酵液：将4℃保存的乳酸菌与酵母菌菌种在无菌环境下接种于MRS、YPD培养基中活化，分别置于37℃培养24h、28℃培养48h，以备后期使用[10]。

母发酵液：将预处理好的马奶分装于三角瓶中，在无菌条件下，将已活化好的乳酸菌与酵母菌种子发酵液按5%接种量接入三角瓶中，摇匀，分别置于37℃培养24h、28℃培养48h。

1.3.4 马奶酒发酵条件优化

（1）单因素试验

分别选取接菌量（乳酸菌/酵母菌）为2%∶6%、3%∶5%、4%∶4%、5%∶3%、6%∶2%，发酵温度为26℃、28℃、30℃、32℃、34℃，发酵时间为24h、48h、72h、96h、120h，糖添加量为4%、6%、8%、10%、12%；进行单因素发酵试验，通过测定酒精度、酸度、糖度以及感官评分进行单因素考察。

（2）响应曲面设计优化试验

在单因素试验结果基础上，根据Box-Behnken中心组合试验设计原理分别对影响酒精度（Y）的3个因素：接菌量（乳酸菌/酵母菌）（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C），利用响应面软件Design-Expert 8.05软件，根据Box-Behnken试验组合设计进行3因素3水平试验。响应面试验的因素和水平编码值见表2。

表2 响应面试验的因素和水平编码值Table 2 Factors and levels of response surface methodology

2 结果与分析

2.1 影响马奶酒发酵的单因素试验

2.1.1 不同接菌量对发酵的影响

表3 不同接菌量对发酵的影响Table 3 Effect of different inoculum on fermentation

酵母菌的含量是影响酒精发酵的重要因素之一[11]。由表3可知，当酵母菌所占的比例较少时，马奶酒的酒精含量较低。酒精积累量随添加酵母菌比例的增大而升高，当接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）比例为3%∶5%，酸马奶酒的酒精含量最高，糖度与酸度均较低，说明大量的糖与酸都转化成了酒精，并且与感官评价结果相符合，因此选择接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）比例3%∶5%最为合适。

2.1.2 不同发酵温度对发酵的影响

表4 不同发酵温度对发酵的影响Table 4 Effect of different temperature on fermentation

发酵温度对菌体的生长繁殖有很大的影响，只有在适宜的温度范围内才能生长并起发酵作用。据文献报道[12]，发酵温度是影响果酒风味的主要因素。由表4可知，当温度为30℃时，马奶酒酒精含量达到最高为1.2%vol，但当发酵温度过高超过30℃时，酵母的繁殖和发酵能力反而下降，酒精的积累也逐渐减少，感官评价得分最高的也是在发酵温度为30℃时获得，因此选择30℃为最为最佳发酵温度。

表5 不同发酵时间对发酵的影响Table 5 Effect of different time on fermentation

2.1.3 不同发酵时间对发酵的影响

随着发酵时间的延长，酵母菌充分生长，酒精度也逐渐升高。由表5可知，当发酵时间为72h时是个拐点，24～72h间马奶酒的酒精含量逐渐升高，当发酵时间在72～120h时，马奶酒的酒精积累量明显降低，结合感官评价发酵72h的马奶酒分数最高为83，说明马奶酒的甜度、酸度、酒精度适中，口感较好，因此选择发酵时间为72h。

2.1.4 不同糖添加量对发酵的影响

表6 不同糖添加量对发酵的影响Table 6 Effect of different sugar addition on fermentation

菌株的发酵能力在一定范围内随着碳源的增加而增强，添加蔗糖为酵母菌和乳酸菌提供了丰富的碳源，增强了菌株的发酵能力，使得马奶酒的酒精含量、糖度、酸度都高于前几组单因素试验结果。由表6可知，加糖量在4%～8%时，酒精度积累量逐渐增加，但当加糖量超过8%时，发酵能力平缓并有下降的趋势，可能是因为添加蔗糖含量过高，马乳中的糖浓度过高，抑制了酵母菌和乳酸菌的生长，从而使得酒精度下降，糖度和酸度较高。感官评价结果显示添加糖含量为6%时，马奶酒的口感较好。因此，综合以上原因选择加糖量为6%最为恰当。

2.2 马奶酒发酵响应面优化分析

综合单因素试验结果，选取对酒精发酵影响较大的3个因素（接菌量、发酵时间、发酵温度）作为响应因素，采用Box-Behnken Design响应面分析法对其进行优化。响应面试验设计及响应值结果见表7。

按照表7试验数据进行多元回归方程拟合，以马奶酒酒精度（Y）为响应值可建立以马奶酒酒精度对接菌量（A）、发酵时间（B）、发酵温度（C）的拟合方程：

表7 响应面试验设计及结果Table 7 Experimental design and result of response surface methodology

表8 响应面试验结果及方差分析Table 8 Variance analysis of response surface experiment results

回归方程中各变量对指标（响应值）影响的显著性，由F检验来判定，概率P的值越小，则相应变量的显著程度越高[13-15]。由表8可知，当模型F=68.44时，P＜0.000 1，说明模型是极显著的。当失拟项F=1.12时，P=0.440 4＞0.05，说明模型失拟项不显著。决定系数R2=0.988 8，校正系数R2Adj=0.974 2，表明酒精度的实测值与预测值之间具有很好的拟合度，由此可以说明模型的建立呈显著性，试验操作准确可信，因此可以利用此模型对马奶酒发酵过程进行分析和预测。

从表8可知，一次项与二次项均对马奶酒的Y值影响表现出极显著水平，交互项AB、AC对马奶酒Y值的影响表现为显著水平，交互项BC对马奶酒Y值的影响不具有显著水平的影响。试验结果可以得出各因素对马奶酒酒精度的影响A＞C＞B，即接种量比例＞发酵温度＞发酵时间。

2.3 响应面图与等高线图分析

为了考察各个交互项对马奶酒酒精度的影响，在其他因素固定不变的情况下，利用Design-Expert 8.05软件对回归方程进行运算，作出交互项的三维响应面图及等高线图，能比较直观的解释各个变量和变量之间对响应值的影响。

图1 各因素相互作用对马奶酒酒精发酵影响的响应面图与等高线图Fig.1 Response surface plot and contour plot of interaction among each two factors of inoculums,fermentation temperature and time on Kumiss fermentation

由图1可以看出，随着接菌量比例的变化，酒精度呈先上升后下降的趋势，发酵时间对马奶酒酒精度影响不明显，其曲线表现较为平滑，发酵时间与接种量比例之间的交互作用不显著；酒精度随发酵温度及接菌量比例的升高呈先上升后下降的趋势，发酵温度及接菌量比例的交互作用显著；随着发酵温度的升高，酒精度呈先上升后降低的趋势，发酵时间与发酵温度的交互作用不显著。

2.4 马奶酒发酵条件优化验证试验

对马奶酒酒精度取最大值，由软件自动分析可得到马奶酒最佳发酵条件理论值为：接菌量（乳酸菌/酵母菌）2.8%∶5.2%、发酵时间80.8h、发酵温度31.68℃，所测酒精度为6.967 82%vol。考虑实际操作方便，选取接菌量（乳酸菌%/酵母菌%）3%∶5%、发酵时间80h、发酵温度32℃，进行3次平行试验，马奶酒的酒精度为7.0%vol、6.9%vol和7.0%vol，说明该数学模型的建立对马奶酒酒精度的预测比较准确。

2.5 产品质量指标

2.5.1 感官指标

外观：酒体乳黄色，有少量蛋白沉淀；香气：具有纯正的乳香，淡淡的酒香；滋味：酒体醇厚，酒香柔和，酸甜协调，无异味；具有本品典型风格。

2.5.2 理化指标

酒精度3%vol～8%vol；总酸（以柠檬酸计）4～8g/L；还原糖（以葡萄糖计）40.1～70.0g/L。

2.5.3 微生物指标菌落总数：1个/mL；大肠杆菌：1个/100mL；致病菌：未检出。

3 结论

在单因素试验的基础上，利用响应面软件，通过接菌量（乳酸菌：酵母菌）、发酵温度、发酵时间3个因素，以马奶酒酒精度为响应值进行模型建立和模型预测，得出马奶酒最佳发酵条件分别为接种量（乳酸菌/酵母菌）3%∶5%，发酵温度32℃，发酵时间80h，糖添加量6%。在此条件下发酵的马奶酒酒精度平均为7.0%vol，说明该数学模型对优化马奶酒发酵条件可行，并为马奶酒工业化成产提供了依据，具有一定的实用意义。

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