野木瓜提取液的抗氧化活性研究

2014-04-24崔霖芸

中国酿造 2014年2期

崔霖芸

（遵义医药高等专科学校基础部，贵州遵义 563003）

自由基是含有一个或多个不对称电子的原子、分子或离子。正常条件下，生物体内仅1%～4%的O2产生超氧阴离子（O2－·）和羟自由基（·OH），但当线粒体的结构与功能受影响时，自由基产生增多[1]。自由基具有很强的氧化能力，若其数量超过机体的清除能力时便会对机体产生损伤，会直接或间接地降低酶活性，促使多糖降解、DNA 链断裂，从而引起体内代谢紊乱，导致各种疾病发生[2]。因此，清除自由基对维持健康、延缓衰老、防癌抗癌等方面均有积极的作用。天然植物中含有丰富的抗氧化性物质（如黄酮类化合物、多酚化合物、多糖化合物等）。研究显示，物质的还原力与其抗氧化性间有显著的正相关性，还原力的高低可反映抗氧化能力的强弱[3]，黄酮类化合物的分子结构中具有数量不等的酚羟基因而具有较强的还原性，是很有潜力的抗氧化剂[4-5]。多酚类化合物是极好的氢或电子供体，且不会引发新的游离基或由于链反应而被迅速氧化，具有很好的抗氧化效果[1]。多糖结构中的醇羟基可以与产生·OH等自由基所必需的金属离子络合，使羟自由基的产生受到抑制[2，6]，从而具有一定的抗氧化性。此外，皂苷类、鞣质类、褪黑素类、不饱和脂肪酸、矿物质等均有一定的抗氧化作用[1]。

野木瓜（Stauntonia chinensis）是木通科（Lardizabalaceae）野木瓜属植物。贵州省正安县于1996 被国务院发展研究中心等单位命名为“中国野木瓜之乡”，其盛产的野木瓜以果大、皮薄、肉细、气香、味甘酸等特点著称[7]。中医典籍记载其茎叶微苦，其果味甘、平，归心、肾经[8]，具有舒筋活络、解渴生津、平肝和胃、祛风止痛等功效。现代研究表明，野木瓜中含有丰富的皂苷和木脂素苷类化合物，还含有黄酮苷类化合物、酚性成分、多糖类化合物[9]。此外，野木瓜果实中含有丰富的有机酸、果胶、胡萝卜素、黄酮类、氨基酸、多种维生素和多种矿物质等[10]，这些物质很多是天然的抗氧化剂。国内外对野木瓜的镇痛抗炎、放射增敏及肝保护等方面的研究较多[11-12]，但对野木瓜提取物的抗氧化能力的研究却很少。显然，在人们日益关注自身保健的今天，若能发现野木瓜的抗氧化功效，将对开发其在保健、防癌抗癌方面的新用途具有积极的意义。

1 材料与方法

1.1 材料与试剂

新鲜野木瓜果：购自贵州正安县。

石油醚（化学纯）：天津市永大化学试剂有限公司；无水乙醇、水扬酸、H2O2、HCl（化学纯）：天津天大化学试剂厂；VC（分析纯）：国药集团化学试剂有限公司；铁氢化钾、三氯乙酸、FeCl3、邻苯三酚（分析纯）：西安三浦化学试剂有限公司；pH=6.6的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液（配制方法见文献[13]）、pH=8.34的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液（配制方法见文献[14]）。

1.2 仪器与设备

752N紫外可见分光光度计：上海仪电分析仪器有限公司；SHZ-DⅢ型予华牌循环水真空泵：巩义市予华仪器有限责任公司；BSA223型电子天平：北京赛多利斯天平有限公司；RE-52A型旋转蒸发器：上海亚荣生化仪器厂；TL80-2型离心机：姜堰市天力医疗器械有限公司；DK-S26 型恒温水浴锅：上海森信实验仪器有限公司；PHS-2F型精密酸度计：上海雷磁仪器厂。

1.3 方法

1.3.1 样品预处理

将野木瓜鲜果洗净→去籽囊切成2～5mm 薄片→50℃烘干→粉碎后过40 目筛→石油醚脱色回流至石油醚无色→抽滤，滤渣风干。

（1）准确称取预处理后的野木瓜粉5g，置入250mL圆底烧瓶中，加入体积分数83%的乙醇151mL，在70℃回流浸提2h，抽滤，滤液在60℃减压浓缩，最后定容至25mL，得野木瓜醇提物。

（2）准确称取处理后的野木瓜粉5g，置入250mL圆底烧瓶中，加入蒸馏水151mL，在70℃回流浸提2h，抽滤，滤液在60℃减压浓缩，最后定容至25mL，得野木瓜水提物。

表1 实验取样方案Table 1 Experimental design of sampling

1.3.2 野木瓜提取液还原力的测定[2，15-16]

试验采用Oyaizu法，主要根据待取液能将Fe3+还原为Fe2+的多少来检测其还原能力。取表1中的各组待试液，分别加入pH=6.6的磷酸二氢钾-磷酸氢二钾缓冲液5.0mL，加入1%（质量分数）铁氢化钾3.0mL，50℃水浴恒温反应20min后急速冷却，加入10%（质量分数）三氯乙酸3.0mL摇匀，于3000r/min离心10min，取上清液2.5mL，依次加入蒸馏水2.0mL，0.1%（质量分数）FeCl30.5mL，摇匀，静置10min，在波长700nm处测吸光度值，吸光度值越大则还原力越强。

1.3.3 野木瓜提取液对羟基自由基（·OH）的清除率的测定[16-18]

采用Fenton法，其基本原理：在过渡金属离子催化作用下，过氧化氢可发生均裂产生羟自由基（·OH），反应式为：

水杨酸捕获·OH产生有色物质，通过测定吸光度值，可以得出·OH的多少，若加入具有清除·OH功能的待测液，便会与水杨酸竞争·OH，从而使反应生成的有色物质减少，由此可测定待测液对·OH的清除能力。

参照上述文献方法，在19支25mL容量瓶中分别加入3.0mL 2mmol/L的FeSO4和3.0mL 6mmol/L的水杨酸，摇匀，加入表1中的各组待测液，最后向各容量瓶中分别加入3.0mL 2mmol/L的H2O2，摇匀后置入37℃水浴锅中恒温反应15min，取出在波长510nm处测吸光度值A，得到各待测液对·OH的清除率：

式中：A0为未加待测液（即加入4mL 蒸馏水）的吸光度值；Ax为加入各待测液后的吸光度值。

1.3.4 野木瓜提取液对超氧阴离子（O2－·）清除率的测定[16，19-20]

参考上述文献的邻苯三酚自氧化法，取pH=8.34的磷酸氢二钠-磷酸二氢钾缓冲溶液4.7mL，加入4.0mL蒸馏水摇匀，加入3mmol/L的邻苯三酚0.3mL（以10mmol/L的HCl配制，空白管用10mmol/L的HCl代替邻苯三酚的HCl溶液），迅速摇匀倒入比色皿（1cm）中，在波长325nm处测吸光度值，每隔30s记录1次，至4.5min止，将所测吸光度值与时间回归，其斜率即为邻苯三酚自氧化速率。

样品清除超氧阴离子自由基的测定：操作方法同上，在加入邻苯三酚前，先将4.0mL蒸馏水换成表1中的各组待测液，按上述方法测吸光度值，回归求得加入待测液后的邻苯三酚自氧化速率。

式中：V0为未加待测液（即加入蒸馏水）时邻苯三酚自氧化速率；Vx为加入待测液后的邻苯三酚自氧化速率。

2 结果与分析

2.1 野木瓜提取液还原力的测定

由图1可见，随着野木瓜提取液（或VC浓度）的增加，吸光度值刚开始迅速增加，当提取液的量增加至1.5mL（或VC浓度增加至0.3mg/mL）后，增长趋于平缓。吸光度值的大小反应了还原力的强弱，由图1可知，还原力由强到弱依次为VC＞野木瓜醇提物＞野木瓜水提物。当加入野木瓜醇提物4mL时（相当于从0.8g野木瓜粉中提取的液量，换算过程为5g÷25mL×4mL=0.8g，参见1.3.1），其还原力只是略低于0.8mg/mL的VC的还原力，说明野木瓜提取物有较强的还原力。还原力与抗氧化性间显著正相关，还原力的高低反映了抗氧化能力的强弱[21]。因此说明野木瓜提取液有较强的抗氧化能力。

图1 野木瓜提取液的还原力Fig.1 Reducing power of S.chinensis extraction solution

2.2 野木瓜提取液对羟基自由基（·OH）的清除作用

图2 野木瓜提取液对·OH的清除Fig.2 ·OH scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

图2是不同量的野木瓜提取液与不同浓度VC对·OH的清除作用的对比曲线。当加入野木瓜提取液的量较少时（或VC浓度较低时），对·OH的清除作用均较小，不到20%，随着添加提取液量（或VC浓度）的增加，清除率迅速上升，其中VC的清除率上升最快，并迅速超过野木瓜提取液的清除能力，野木瓜两种提取介质（乙醇和蒸馏水）的提取液对·OH的清除作用差别不明显。当加入提取液的量超过2mL（或加入VC的质量浓度超过0.4mg/mL）后对·OH的清除作用增速趋于平缓。当加入4mL野木瓜提取液（相当于从0.8g野木瓜中提取的量），对·OH的清除率可达77.42%（水提物）和76.66%（醇提物），与0.246mg/mL VC的清除率79.26%几乎相当（即加入4mL的0.8mg/mL VC的清除率，总反应液量为13mL（见1.3.3），因此，反应液中VC的质量浓度为0.246mg/mL，说明野木瓜提取液对·OH有很好的清除作用。

2.3 野木瓜提取液对超氧阴离子（O2－·）的清除作用

图3 野木瓜提取液对清除Fig.3 scavenging effects of the S.chinensis extraction solution

图3给出了不同量的野木瓜提取液与不同浓度VC对超氧阴离子（O－2·）的清除作用对比，野木瓜乙醇提取液对O－2·的清除作用明显高于其水提取液，这可能是乙醇提取液中溶出了更多黄酮类化合物的原故。野木瓜醇提物对O－2·的清除作用与VC的作用几乎相当，变化也相似。在加入醇提物的量较少（或VC浓度较低时），对O－2·的清除作用也较小，不到35%，但随着量的增加，清除作用迅速增加，在超过2mL后（此时清除率达到87.42%）增速趋于缓和。当加入4mL提取液量（相当于从0.8g野木瓜粉中提取的液量），对O2－·的清除率可达到96.36%（乙醇提取），与0.356mg/mL的VC的清除率96.69%相当（此处即为加入4mL 0.8mg/mL的VC时的清除率，总反应液量为9mL（见1.3.4），因此，反应液中VC的质量浓度为0.356mg/mL），说明野木瓜乙醇提取液对O－2·有很好的清除作用。野木瓜水提取物对O－2·的清除作用稍小，但当加入液量为4mL时，也达到90.78%，说明野木瓜水提物对O－2·也有较好的清除作用。

3 结论

实验证实野木瓜乙醇提取液的还原力高于其水提取液的还原力，但均略低于VC的还原力，但在清除羟基自由基（·OH）能力上，醇提物与水提物及一定浓度的VC大致相等，野木瓜乙醇提取物对超氧阴离子（O－2·）的清除力与VC相当，超过了96%，高于水提物的清除力。本实验的不足在于，由于实验条件及时间的局限，没有对野木瓜提取液的成分进行定量分析，但据文献报道可推测野木瓜的抗氧化性主要可能来源于野木瓜中的黄酮类化合物、多酚类化合物、多糖类化合物[1-6]。醇提物在总还原力和对超氧阴离子的清除力上均高于水提物，可能是由于醇提物中溶解了更多的黄酮和多酚类化合物（根据极性相似相溶原理），而水提物中溶解了更多的多糖类化合物，提高了水提物对羟自由基的清除作用（多糖类化合物对羟自由基有较好的清除作用[2，6]）。本研究从总体上证明了野木瓜有很好的抗氧化作用，是一种较好的天然抗氧化剂，因此，对推广和开发野木瓜饮品、食品、保健药品等具有一定的指导作用。

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