潜阳育阴颗粒含药血清对 AngⅡ诱导 HUVEC损伤 NO的影响

王欣彤, 方祝元*, 严士海, 陈 艺, 张思奇

（1.江苏省中医院, 江苏 南京 210029； 2.南京中医药大学, 江苏 南京 210029）

潜阳育阴颗粒含药血清对 AngⅡ诱导 HUVEC损伤 NO的影响

王欣彤1, 方祝元1*, 严士海1, 陈 艺2, 张思奇2

（1.江苏省中医院, 江苏 南京 210029； 2.南京中医药大学, 江苏 南京 210029）

目的 探讨潜阳育阴颗粒 （鬼针草、 川牛膝、 山萸肉、 玄参、 制首乌、 泽泻） 含药血清对血管内皮损伤的作用。 方法 建立 AngⅡ诱导的人脐静脉内皮细胞凋亡损伤模型， 采用 TBA法检测 NO水平， Western blot法检测 eNOS及 iNOS 蛋白表达， ELISA法检测 NADPH氧化酶水平， 用 SPSS 17.0 软件对数据进行统计学分析。 结果 模型组 NO及 eNOS 蛋白表达较正常组降低， NADPH氧化酶则明显升高; 缬沙坦组及潜阳育阴颗粒高剂量组 NO明显升高， 且两者之间有统计学组差异， 而潜阳育阴颗粒低剂量组则无显著性差异; 缬沙坦组及潜阳育阴颗粒的 eNOS 蛋白表达显著升高， NADPH氧化酶水平明显下降; 各组 iNOS 表达差异不明显。 结论 潜阳育阴含药血清对 AngⅡ诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞损伤具有类似缬沙坦样的保护作用。

潜阳育阴颗粒; 缬沙坦; 人脐静脉内皮细胞; 血管紧张素Ⅱ （AngⅡ）; 一氧化氮 （NO）

高血压作为一种常见病，高发病，可引起心、肾等重要脏器的损害，严重危害人类健康。血管紧张素Ⅱ （Angiotensin Ⅱ， AngⅡ） 是肾素血管紧张素系统的主要活性肽，增加血管内皮还原型辅酶Ⅱ（NADPH） 氧化酶的表达和活性， 产生大量活性氧（ROS）， 诱导血管相关基因和蛋白改变， 抑制血管NO的 生 成，损 伤 血 管的 舒 缩 功能［1-2］。潜阳 育 阴颗粒是防治高血压及其肾损害的有效院内制剂，动物研究证实其 对高血压肾 损伤有 保护作 用［3-4］。 本次研究观察潜阳育阴颗粒含药血清对 AngⅡ诱导体外培养的人脐静脉内皮细胞 （HUVEC） 的影响，以探讨该药对血管内皮损伤的保护作用机制。

1 材料与方法

1.1 细胞株 HUVEC购自 ATCC公司，Number为 CRL-1730。

1.2 动物 雌性 SD大鼠 24 只， 体质量 （280 ± 20） g， 由南通大学实验动物中心提供， 实验动物生产许可证号:SCXK （苏） 2008-0010。 大鼠饲养于江苏省中医院实验动物中心，实验动物使用许可证号:SYXK （苏） 2007-0017。

1.3 药物 潜阳育阴颗粒， 由鬼针草、 川牛膝、山萸肉、 玄参、制首乌、 泽泻组成， 加水10倍量，煎煮2次，收集药液，浓缩，喷雾干燥，制成颗粒剂， 10 g/包， 由江苏省中医院制剂部提供， 批号111103; 缬沙坦胶囊， 80 mg/粒， 由北京诺华制药有限公司提供，批号 X1265。 均用蒸馏水配制。 潜阳育阴颗粒，10 g/（kg·d），100 g药物加入 100 mL蒸馏水， 药物剂量根据中药药理方法， 选用成人临床剂量的10倍。

1.4 试剂及仪器 血管紧张素 II（human， SIGMA公司， SLBC0951V）; 酶标仪 （瑞士 TECAN公司，SUNRISE）;Human NADPH ELISA KIT （ R&D 公司， 20120702）;Western 电泳仪 （Bio-Rad， America， 164-5051）; 全 蛋 白 抽提试剂盒 （ KGP250）、Braford 蛋白定量检测试剂盒 （KGA801）、 5 ×SDSPAGE蛋白上样缓冲液 （KGP101）、 SDS-PAGE凝胶 配 制 试 剂 盒 （ KGP113 ）、 WB 一 抗 稀 释 液（KGP106）、 WB二抗稀释液 （ KGP107）、 Western blot抗体清除缓冲液 （KGP110）、 ECL检测试剂盒（KGP1123）、 二抗 （羊抗兔 IgG） （KGAA35）， 均由南京凯基生物科技发展有限公司提供;NO检测试剂盒 （南京建成生物工程研究所， 20120508）;紫外线分光光度计 （上海光谱仪器有限公司， SP-756PC）。

1.5 实验方法

1.5.1 含药血清制备 SD大鼠随机分为正常组（等量蒸馏水）、 缬沙坦组 ［0.027 g/（ kg·d）］、潜阳育阴颗粒组 ［10 g/（kg·d）］， 每组 8 只。 灌胃给药， 每日1 次， 连续6 d， 末次给药后1 h， 颈总动脉采血， 3 000 r/min 离心 10 min， 取血清，56 ℃、 30 min 水浴灭活， 经 0.22 μm滤膜抽滤除菌， 分装， -20 ℃保存备用。

1.5.2 体外培养 HUVEC 细胞生长至 80%融合，弃去旧的培养液， PBS 轻轻荡洗 2 次， 加入 2 mL 0.25%胰酶消化， 37 ℃温育 2 min， 显微镜下见细胞圆缩、 间隙增大时， 立即弃去消化液， 用 PBS轻轻荡洗 1 次， 加 入适量 含 10% 胎牛血清的DMEM完全培养液， 反复吹打，使之成为单个悬浮细胞， 分成 2 瓶， 37 ℃ 5%CO2培养箱内培养。

1.5.3 分组及干预方法 分别以 104～105的细胞计数量将细胞接种于 96 孔板和大约 105的细胞计数量将细胞接种于 6 孔板内培养 24 h。 分为 5 组，除正常组外， 其余组均采用 10-6mol/L AngⅡ作用于对数生长期的 HUVEC建立细胞凋亡损伤模型。造模后，取含药血清，按组分别配制培养液进行干预: 正常组 （16%空白血清培养液， 16 mL空白血清 +84 mL不完全培养液）、模型组 （16%空白血清培养液，16 mL空白血清 +84 mL不完全培养液）、 缬沙坦组 （16%缬沙坦血清培养液， 16 m L缬沙坦血清 +84 mL不完全培养液）、 潜阳育阴颗粒低剂量组 （8%潜阳育阴颗粒血清培养液 +8%空白血清培养液， 8 mL潜阳育阴颗粒血清 +8 m L空白血清 +84 mL不完全培养液）、 潜阳育阴颗粒高剂量组 （16%潜阳育阴颗粒血清培养液， 16 mL潜阳育阴颗粒血清 +84 mL不完全培养液）， 继续培养 24 h［5］。 96 孔板按组取细胞上清放入离心管中， 编号后置于 -70 ℃冰箱保存待测;6 孔板内培养细胞用以 Western Blot和 RT-PCR检测。

1.5.4 NO的检测 从 -70 ℃液氮中取各组细胞上清标本、4℃冰箱中取出NO试剂盒，置于室温平衡溶化。 采用硫代巴比妥酸 （TBA） 法，按照试剂盒内说明书进行检测。

1.5.5 eNOS、 iNOS 蛋白的检测 采用蛋白质印迹法 （ Western blot）［6-7］。

消化、洗涤6孔板内贴壁细胞后，进行蛋白样本的提取制备、 Bradford 法蛋白定量、 SDS-PAGE、电泳、湿电转移、封闭、抗体与靶蛋白的结合等处理，最后在暗室中曝光、显影、洗像，保存显示有目的条带的胶片， 以 actin 为内参照， 应用图象分析仪对条带做扫描半定量。

1.5.6 NADPH氧化酶的检测 从 -70 ℃液氮中取各组细胞上清标本、4 ℃冰箱中取出 NADPH氧化酶 ELISA试剂盒， 置于室温平衡溶化。 采用酶联免疫法 （ELISA法）， 按照试剂盒内说明书进行检测。

1.6 统计学方法 采用 SPSS 17.0 软件进行统计，单因素方差分析， 结果用表示， 两两组间比较采用t检验。

2 实验结果

2.1 潜阳育阴颗粒对 AngⅡ诱导 HUVEC损伤后NO水平的影响 结果显示 （见表 1）: 与正常组比， 模型组 NO明显降低 （P＜0.01）; 与模型组比，缬沙坦组及潜阳育阴颗粒高剂量组NO明显升高 （P＜0.01）， 而潜阳育阴颗粒低剂量组则无显著性差异 （P＞0.05）。

表1 各组 NO水平的比较 （）Tab.1 Comparison of NO content in each group（）

表1 各组 NO水平的比较 （）Tab.1 Comparison of NO content in each group（）

注: 与正常组比较，△△P＜0.01; 与模型组比较，**P＜0.01

组 别 剂 量 /（ g·kg-1） 例 数 NO/（ μmol·L-1）6 146.73 ±11.86模型组 - 6 91.48 ±7.62△△缬沙坦组 0.027 6 140.79 ±12.28**潜阳育阴颗粒低剂量组 5 6 101.77 ±11.67潜阳育阴颗粒高剂量组 10 6 121.36 ±10.25正常组-**

2.2 潜阳育阴颗粒对 AngⅡ诱导 HUVEC损伤后eNOS、iNOS 蛋白表达的影响 结果显示 （ 见表2、 图 1）: 与正常组比， 模型组 HUVEC损伤后eNOS 蛋白表达明显下降 （P＜0.05）; 与模型组比，予以潜阳育阴颗粒含药血清干预后可不同程度提升 eNOS 蛋白表达 （P＜0.05，P＜0.01）; 缬沙坦也可显著升高 eNOS 蛋白表达 （P＜0.01）。 各组iNOS 表达差异不明显 （P＞0.05） 。

表 2 各组 eNOS及 iNOS蛋白表达的比较 （）Tab.2 Com parison of eNOS and iNOS protein expression in each group（）

表 2 各组 eNOS及 iNOS蛋白表达的比较 （）Tab.2 Com parison of eNOS and iNOS protein expression in each group（）

注: 与正常组比较，△P＜0.01; 与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

组别 剂量/（ g·kg-1） 例 数 （ eNOS/actin） （ iNOS/actin）0.48+0.04 - 3 0.45+0.09 0.46+0.06模型组 - 3 0.21+0.07△0.43+0.04缬沙坦组 0.027 3 0.44+0.02**0.45+0.08潜阳育阴颗粒低剂量组 5 3 0.34+0.03*0.47+0.03潜阳育阴颗粒高剂量组 10 3 0.52+0.04**正常组

2.3 潜阳育阴颗粒对 AngⅡ诱导 HUVEC损伤后NADPH氧化酶的影响 结果显示 （见表 3）: 与正常组比， 模型组 NADPH氧化酶明显升高 （P＜0.01）; 与模型组比， 予以缬沙坦、 潜阳育阴颗粒含药血清干预后 NADPH氧化酶水平均明显下降（P＜0.05）。

图1 各组 NOS蛋白电泳图Fig.1 NOS protein electrophoresis in each group

表3 各组 NADPH氧化酶的比较 （）Tab.3 Com parison of NADPH oxidase in each group（）

表3 各组 NADPH氧化酶的比较 （）Tab.3 Com parison of NADPH oxidase in each group（）

注: 与正常组比较，△△P＜0.01; 与模型组比较，**P＜0.01

组别 剂 量 /（ g·kg-1） 例数 NADPH/（ nmol·mL-1）- 6 97.75 ±16.13模型组 - 6 202.43 ±17.05△△缬沙坦组 0.027 6 165.56 ±4.74**潜阳育阴颗粒低剂量组 5 6 157.00 ±14.21**潜阳育阴颗粒高剂量组 10 6 120.13 ±10.13正常组**

3 讨论

血管内皮细胞 （VEC） 是覆盖在血管内腔表面的连续单层扁平细胞， 起屏障作用［8］。 它可分泌 NO、 AngⅡ等多种强效血管活性物质， 参与心血管疾病的发生发展，血管内皮功能失调与许多心血管疾病特别是高血压的发病有关。氧化应激是指机体在遭受各种有害刺激时，体内高活性分子如活性氧自由基 （ROS） 和相关物质产生过多的一种状态。目前已证实，氧化应激是发生高血压的机制之一。 NADPH氧化酶是诱导机体产生 ROS 的主要活性酶， 而 AngⅡ是激活 NADPH氧化酶的最主要刺激因子［9-10］。 AngⅡ-NADPH 氧化酶-ROS 信号转导途径使血管内皮功能受损，血管内皮自身调节体系失衡，导致NO合成和释放减少，内皮依赖性舒张功能下降，形成高血压。因此本实验应用 AngⅡ诱导 HUVEC凋亡损伤模型， 探讨潜阳育阴颗粒的血管保护作用。

VEC是 NO的主要生成细胞。机体内的 NO由左旋精氨酸胍基末端的氮原子与分子氧在一氧化氮合成酶 （NOS） 催化合成。 NO生成后， 可快速扩散透过细胞膜，作用于邻近靶器官，参与高血压等病理生理过程。其中 NOS是生成 NO的关键环节。人体内存在3种一氧化氮合成酶亚型:分别为神经型 NOS （nNOS）、 诱导型 NOS （iNOS） 和内皮型NOS （eNOS）。 其中与高血压密切相关的是 eNOS和 iNOS。 剔除 eNOS 基因的小鼠与正常小鼠相比，血压 明 显 升 高， 说 明 eNOS 的 表 达 与 高 血 压有关［11］。

本研究显示: 与正常组比， 模型组 NO及eNOS 蛋白表达明显降低，与模型组相比， 缬沙坦组及潜阳育阴颗粒高剂量组NO明显升高，而潜阳育阴颗粒低剂量组则无显著性差异;予缬沙坦组及潜阳育阴颗粒干预后， eNOS 蛋白表达显著升高;各组 iNOS 表达差异不明显。 提示由 eNOS/NO途径释放的NO是血管中 NO的主要来源， 潜阳育阴颗粒在有效降压的同时，可提高 NO的水平，且与剂量相关， 同时又可提高 eNOS 蛋白表达， 维持机体的稳态。

NADPH氧 化 酶 是 生 成 ROS 的 主 要 酶 体。AngⅡ作为 RAS 的主要效应分子， 同时又是 NADPH氧化酶的刺激因子， 在高血压的发生发展中发挥重要作用。临床及实验皆证实，高血压与NO呈负相关、与 AngⅡ呈正相关， AngⅡ与 NADPH氧化酶呈正相关［12-14］。 本 研究表明， 模型组 NADPH氧化酶明显升高，予缬沙坦组及潜阳育阴颗粒干预后 NADPH氧化酶水平明显下降。 说明在高血压状态时，AngⅡ-NADPH 氧 化 酶-ROS 信 号 通 路 被激活， 抑制 eNOS 的表达， 抑制 NO的分泌， 导致血管内皮功能障碍，推测潜阳育阴颗粒可以抑制NADPH氧化酶活性， 从而发挥血管保护作用。

高血压病早期中医辨证主要为 “肝阳上亢”，并兼有 “肝肾阴虚， 瘀阻络脉”， 故对其治疗当以补泻同施，滋补肝肾，清肝平阳，通络逐瘀。潜阳育阴颗粒取山萸肉、玄参、制首乌滋补肝肾，并可滋阴涵阳;川牛膝、泽泻泄浊、引火下行;又有鬼针草、川牛膝通络逐瘀，条畅经脉。此方 “三补”、 “二泻” 暗合六味地黄丸三补三泻之意， 泽泻、鬼针草、玄参兼泻火，故全方补泻同施、寓补于泻，寓泻于补，共奏清肝泻火，滋水涵木，通脉逐瘀，正合高血压病早期肾损害者之候。本实验结果证明潜阳育阴含药血清对 AngⅡ诱导体外培养的HUVEC损伤具有保护作用，其可能的机制是通过抑制 NADPH氧化酶活性，上调 eNOS 的蛋白表达，介导NO的产生，从而改善由高血压所致的血管内皮细胞功能障碍。

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Impact of Qianyang Yuyin Granules containing serum on AngⅡ inducing HUVEC injuring NO

WANG Xin-tong1， FANG Zhu-yuan1*， YAN Shi-hai1， CHEN Yi2， ZHANG Si-qi2

（1.Jiangsu Provincial Hospital of TCM， Nanjing 210029， China;2.Nanjing University of Chinese Medicine， Nanjing 210029， China）

AIM To study the impact of serum containing Qianyang Yuyin Granules（ Bidens bipinnata Linn，Cyathulae Radix， Corni Fructus， Scrophulariae Radix， Polygonimultiflori Radix praeparata， Alismatis Rhizoma）on vascular endothelial cells.METHODS The apoptosismodel of human umbilical vein endothelial cells（HUVEC） was established by AngⅡ induction.TBA meathod was used for NOmeasurement.Western blotwas used for the contents of eNOS and iNOS， and ELISA for the content of NADPH oxidase， respectively.Software SPSS17.0 was used to perform statistical analysis.RESULTS The protein expressions of NO and eNOS in the model group decreased compared with the normal group while NADPH oxidase increasedmarkedly.The NO level in the valsartan group and high dose Qianyang Yuyin Granules group obviously increased except in the lower doses group， which did not show obvious difference.Valsartan group and Qianyang Yuyin Granulesmade the protein expression of eNOS go up and the NADPH oxidase levelmarkedly go down with statistical difference.The expression of iNOS showed no difference among groups.CONCLUSION Qianyang Yuyin Granules have a Valsartan-like protective effect on AngⅡ-induced injury to cultured HUVEC in vitro.

Qianyang Yuyin Granules;Valsartan;human umbilical vein endothelial cells（ HUVEC）; AngⅡ;NO

R285.5

:A

1001-1528（2014）12-2467-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.005

2013-11-29

教育部博士点专项课题项目资助 （20123237110005）; 国家自然基金课题资助 （81273713）

王欣彤 （1988—）， 女， 硕士生， 研究方向: 心血管疾病。 Tel:15850520209

*通信作者: 方祝元， 主任中医师， 博士生导师， 研究方向: 心血管疾病的治疗。 E-mail:jsfy@jsmail.com.cn