疏肝健脾方对 CCl4诱导的肝纤维化大鼠尿液代谢组学的影响

姜 辉, 吴芙蓉, 高家荣*, 陈金锋

（1.安徽中医药大学第一附属医院, 国家中医药管理局中药制剂三级实验室, 安徽 合肥 230031； 2.安徽省立医院药剂科, 安徽 合肥 230001）

疏肝健脾方对 CCl4诱导的肝纤维化大鼠尿液代谢组学的影响

姜 辉1, 吴芙蓉2, 高家荣1*, 陈金锋1

（1.安徽中医药大学第一附属医院, 国家中医药管理局中药制剂三级实验室, 安徽 合肥 230031； 2.安徽省立医院药剂科, 安徽 合肥 230001）

目的 观察疏肝健脾方 （茵陈、 柴胡、 黄芪、 白芍、 枳壳、 白术、 猪苓、 茯苓、泽兰） 对肝纤维化大鼠尿液代谢谱的影响并推测其作用机制。 方法 皮下注射 50%CCl4橄榄油溶液诱导肝纤维化的 SD大鼠随机分为模型组和疏肝健脾方组， 并设正常组， 连续给药 12 周后， 收集大鼠尿液， 用 GC-TOF/MS 技术结合主成分分析、 偏最小二乘方-判别模式、 正交偏最小二乘方-判别模式法鉴定其代谢谱化合物变化。 结果 模型组中的 2-羟基丁酸、 异亮氨酸、 beta-丙氨酸、氨基丙二酸、胞嘧啶、赖氨酸与正常组相比含有量显著升高，疏肝健脾方能够使6个生物标志物向正常水平靠近。结论 疏肝健脾方对化学性肝纤维化大鼠有一定的保护作用，其机制可能与调节能量代谢、嘧啶合成代谢、氨基酸代谢有关。

疏肝健脾方; 肝纤维化; 代谢组学;GC-TOF/MS

肝纤维化 （ hepatic fibrosis） 是各种损肝因素引起的一种组织损伤-修复应答，以细胞外基质过度沉积为其主要表现，是一切慢性肝病的共同病理学基础［1］。 代谢组学是继基因组学、 转录组学和蛋白质组学之后，系统研究病理生理刺激后代谢产物的变化规律，揭示机体生命活动代谢本质的科学，与中医 学 的 “整 体 观 ” 思 想 相 吻 合［2-3］。因此，将代谢组学方法 “导入” 中药作用机制研究，具有广阔的运用前景。

疏肝健脾方又名肝乐颗粒，为安徽中医药大学第一附属医院治疗急慢性肝炎、肝纤维化、肝硬化活动期的特色院内制剂，具有疏肝解郁、健脾渗湿、活血化瘀之功效。 本实验旨在通过 GC-TOF/ MS技术从代谢组学的角度， 探讨疏肝健脾方抗肝纤维化的可能机制。

1 材料

1.1 实验动物 SD大鼠， 体质量 （200 ±20） g，雄性， 由安徽医科大学实验动物中心提供， SPF级。 室温18 ～22 ℃， 相对湿度40% ～60%， 动物自由进食、饮水。

1.2 药品与试剂 疏肝健脾方 （安徽中医药大学第一附属医院制剂， 批号 20121109），主要由茵陈、柴胡、黄芪、白芍、枳壳、白术、猪苓、茯苓、泽兰等药物组成。按处方比例称取药材，第1次加 10 倍量水， 煎煮 1.5 h; 第 2、 第 3 次加 8 倍量水， 煎煮 1.0 h; 合并提取液滤过， 静置沉淀 48 h。 吸取上清液， 减压浓缩至密度为 1.15 g/cm3的流浸膏，加入糊精作底料，喷雾干燥制粒即得。四氯化碳 （天津市富宇精田化工有限公司， 批号12020）;L-2-氯苯丙氨酸 （ 上海恒柏生物科技有限公司， 批号 CAS103616-89-3）; 甲醇 （ 国药集团化学试剂有限公司， 批号 20130129）; 三氯甲烷 （天津市福晨化学试剂厂， 批号 20100512）。

1.3 仪器 GL-20A全自动冷冻高速离心机 （湖南仪器仪表总厂离心机厂）;GC色谱仪 （ Agilent 7890A， Agilent， USA）; 质 谱 仪 （ LECO Chroma TOF PEGASUS 4D， LECO， USA）;-80 ℃超低温冰箱 （三洋公司）;37 ℃温箱 （湖北省黄石市医疗器械厂）。

2 方法

2.1 模型复制与给药［4]SD大鼠， 雄性， 适应性饲养1周后，随机分为正常组、模型组、疏肝健脾方 （16.2 g/kg） 组。 除正常组外， 其余各组分别于大鼠背部皮下注射 50%CCl4（0.1 mL/100 g），正常组给予相应橄榄油， 每周 2 次， 连续 12周。造模第1天起，疏肝健脾方组灌胃给予相应剂量的药物，正常组、模型组给予等量溶媒，每天1次，连续12周。

2.2 肝组织病理学检查 麻醉大鼠， 取固定部位肝组织， 置于4%多聚甲醛液中固定， 常规脱水、透明、浸蜡、包埋、切片、HE染色、脱水、 透明、封片，普通光学显微镜下观察病理组织学改变。

2.3 尿液样本的采集与制备 末次给药后， 低温下采集正常组、 模型组、 疏肝健脾方组大鼠 12 h尿液， 置于 -80 ℃冰箱中冻存，待测。 常温下解冻， 混匀样品， 取 100 μL，加入 10 μL尿素酶（160 mg/m L） 于 100 μL尿液样本中， 振荡混匀，37 ℃培养箱孵育 1 h; 再加入 0.35 m L甲醇-三氯甲烷混合液 （3 ∶1）， 再加入 50 μL L-2-氯苯丙氨酸， 漩涡混匀; 紧接着将样本 4 ℃， 12 000 r/min离心 10 min; 移液管取出 0.35 m L上清于 2 mL进样瓶 （甲烷硅基化的） 中; 在真空浓缩器中干燥提取物; 向干燥后的代谢物加入80 μL甲氧胺盐试剂 （甲氧胺盐酸盐， 溶于吡啶 20 mg/mL），轻轻混匀后， 放入烘箱中37 ℃孵育2 h; 向每个样品中迅速加入 100 μL BSTFA （含有 1%TCMS， v/v），将混合物 70 ℃孵育 1 h; 冷却至室温， 供 GC-MS分析。

2.5 统计学方法 Chroma TOF4.3X软件和 LECOFiehn Rtx5 数据库被用来进行峰提取、 峰基线过滤和校准、峰对齐、反褶积分析及峰识别和集成分析［5］。将共有峰的相对峰面积导入 DEMO （ Umetrics AB， Umea， Sweden） 软件， 经归一化处理后进行 （ Principal Component Analysis， PCA）、 （ Partial Least Squares-Discriminate Analysis，PLS-DA）、（Orthogonal Projections to Latent Structures Discriminant Analysis， OPLS-DA） 模式识别分析; 本实验应用Student-t检验处理所得的 GC-MS 数据。

3 结果

3.1 各组大鼠肝脏病理组织学改变 HE染色显示:正常组大鼠肝组织结构完整，肝索排列规则有序，肝细胞大小、形态一致，细胞核大而圆，核膜清晰，核仁明显;模型组大鼠肝组织中有大量脂肪空泡形成，部分空泡细胞融合，形成较大的囊泡结构，肝小叶结构遭到破坏，细胞索排列紊乱，纤维结缔组织大量增生，有明显的假小叶形成;疏肝健脾方组干预后 12周后，脂肪变性、纤维组织增生明显减少，假小叶形成得到改善，肝纤维化呈现好转的趋势，结果如图1所示。

图 1 疏肝健脾方对 12 周模型大鼠肝组织病理性改变的影响 （HE×200）Fig.1 Effects of Shugan Jianpi Formula on liver histological exam ination of hepatic fibrosis rats（HE×200）

3.2 各组大鼠血清 GC-TOF/MS 总离子图 基于LECO-Fiehn Rtx5 数据库，总共得到 519 种代谢化合物， 再通过 Chroma TOF4.3X软件对数据校正后补齐空白值，消除数据噪音，然后用内标归一，最终得到447 种代谢化合物。 为了进一步说明代谢谱的不同，对代谢谱进行预处理并运用模式识别技术对其进行分析。结果如图2所示。

3.3 各组大鼠尿液样本主成分分析 （PCA） PCA是对高纬数据降维的方法， 是将分散在一组变量的信息集中到二、三个综合指标 （主要成分）上，从而利用主要成分提取数据集的特征，是对原始数据的真实再现。实验结果表明，由于各种因素的干扰，正常组、模型组、疏肝健脾方组基本未分开，各组内样本间差异较大，且正常组、疏肝健脾方组各有一点与其它组具有明显差异。结果如图3所示。

图 2 正常组、 模型组、 疏肝健脾方组大鼠尿液样品 12周总离子图Fig.2 Typical total GC/TOFMS TIC chrom atogram s of rat urine sam p les obtained for all three groups at 12-week

图3 正常组、 模型组、 疏肝健脾方组大鼠尿液样品12 周 PCA得分图Fig.3 The PCA score plot of rat urine sam ples obtained for the three groups at 12-week

3.4 各组大鼠尿液样本偏最小二乘法判别分析（PLS-DA） 由于 PCA图并未能完全分离， 因此，为了获取更加理想的组间分离及增强对分类贡献大的变量的识别， 进行了 有监督 的 PLS-DA分析。PLS-DA主要是先拿对组间区分性大的部分数据建立类别间的数学模型，然后再拿剩余的部分数值去比对，得出一些评判数值如监督模型的解释率（R2Y）、模型的预测能力 （Q2）。 实验结果表明，进行 PLS-DA分析后， 正常组、 模型组、 疏肝健脾方组完全被分开， R2Y=0.832， Q2=0.274， 可见该模型稳定性、拟合能力及预测能力均较好。在此之后， 通过排列实验随机多次 （n=200）改变分类变量y的排列顺序得到相应不同的随机Q2值对模型有效性做进一步的检验。 通过排列实验获得的 R2= 0.476， Q2=-0.178， Q2 负值表明该模型是可靠的，模型未存在过拟合现象。结果如图4所示。

图 4 正常组、 模型组、 疏肝健脾方组大鼠尿液样品 12 周的 PLS-DA得分图及置换检验Fig.4 The PLS-DA score and cross-validation of rat u rine sam p les obtained for the th ree groups at 12-week

3.5 各组大鼠尿液样本正交偏最小二乘法判别式分析 （OPLS-DA） 正交信号校正技术 （ OSC）可以滤掉与类别判断正交 （不相关）的变量信息，只保留与类别判断有关的变量，从而使类别判别分析能集中在这些与类别的判别相关的变量上，提高了判别的准确性［6］。 通过对 OPLS-DA模型进行正交矫正处理，构建了 OPLS-DA图。实验结果表明，进行 OPLS-DA分析后， 正常组、 模型组、 疏肝健脾方组完全可被分开，提示造模后大鼠尿液的内源性代谢物与正常对照组有明显变化，疏肝健脾方干预12周后可影响肝纤维化大鼠的体内代谢。 结果如图5所示。

图5 正常组、 模型组、 疏肝健脾方组大鼠尿液样品12 周的 OPLS得分图Fig.5 OPLS-DA score of rat urine samples obtained for the three groups at 12-week

3.6 各组大鼠生物标志物的筛选及鉴定 为了使分析更深一步， 通过将 VIP（变量重要性投影值）＞1 及 P＜0.05 的化合物筛选出来作为差异性化合物。根据变量对应的保留时间，得到其质谱图，利用 LECO-Fiehn Rtx5 数据库对具有明显差异的化合物进行结构鉴定。 基于以上分析， 2-羟基丁酸、 异亮氨酸、 beta-丙氨酸、丙二酸、 胞嘧啶、 赖氨酸 6个内源性代谢物被筛选出来作为具有明显差异的化合物。 与正常组相比， 模型组 2-羟基丁酸、 异亮氨酸、 beta-丙氨酸、 氨基丙二酸、 胞嘧啶、 赖氨酸水平显著升高;给予疏肝健脾方干预后，与模型组相比， beta-丙氨酸、 氨基丙二酸、 胞嘧啶、 赖氨酸水平显著下降， 2-羟基丁酸、 异亮氨酸虽有所下降，但不具有统计学意义;与正常组相比，上述6种物质水平虽均有所上升，但不具有统计学意义，提示疏肝健脾方有使紊乱的代谢谱向正常回归的趋势。结果如表1所示。

表1 各组大鼠生物标志物及其变化趋势Tab.1 Identifieation results of the 6 differentialm etabolites and changed tendency of rat urine sam p les at 12-week

4 讨论

代谢组学是以组群指标分析为基础，高通量检测和数据处理为手段，定性定量研究生物体的内源性代谢产物，分析生物体在不同状态下的代谢指纹图谱的差异，获得相应的生物标志物群，从而揭示生物体在特定时间、环境下的整体功能状态的科学［7-8］。

肝脏是机体物质代谢的中枢器官，具有特有的功能和某些酶系，体内多种激素、氨基酸、糖、脂质、蛋白质等代谢都是在肝脏中进行的［9］。 因此，从代谢组学的角度，对肝脏和肝脏疾病进行系统研究尤为重要。 本实验采用 GC-TOF/MS 技术， 从代谢组学的角度，研究疏肝健脾方防治大鼠化学性肝纤维化的作用机制研究。结果表明，疏肝健脾方可改善肝纤维化大鼠病理组织学损伤程度，且有使紊乱的代谢谱向正常回归的趋势。这些明显变化的代谢物可部分解释疏肝健脾方的作用机制。

2-羟基丁酸是由 alpha-丁酮酸衍生而成的一种有机酸， 与谷胱甘肽合成代谢与能量代谢有关［10］。谷胱甘肽能够保护肝脏免受氧化应激损伤，与肝脏疾病关系密切［11］。 模型组大鼠尿液中 2-羟基丁酸水平显著升高，表明模型组存在谷胱甘肽与能量代谢异常; 给予疏肝健脾方干预后， 可下调 2-羟基丁酸水平，提示其可改善肝纤维化大鼠紊乱的谷胱甘肽合成与能量代谢。

异亮氨酸为支链氨基酸，是哺乳动物体内合成肝葡萄糖的生糖型氨基酸。异亮氨酸经氨基转移及脱羧反应生成的 α-甲基丁酰辅酶 A， 进行类似脂肪酸的分解后，生成乙酰辅酶A与丙酰辅酶A，后者成为琥珀酰辅酶A，进入柠檬酸循环。模型组大鼠尿液中异亮氨酸水平显著升高，与文献报道一致［12］。 经疏肝健脾方干预后， 可使升高的异亮氨酸水平明显得到下调，推测是由于三羧酸循环恢复到正常，为了弥补模型形成期能量的缺乏而消耗了更多中间产物。

有文献报道，丙二酸、胞嘧啶均参与嘧啶的合成代谢［13］。 嘧啶的合成代谢包括氧化分解和从头合成两条途径，主要在肝脏中进行。首先，通过核苷酸酶及核苷酸磷酸化酶的作用，分别除去核糖和磷酸生成嘧啶碱， 再进一步分解生成 β-丙氨酸等。β-丙氨酸是辅酶 A的组分， 辅酶 A为体内乙酰化反应的辅酶，对糖、脂肪及蛋白质的代谢起重要作用。与正常组相比， 模型组丙二酸、 胞嘧啶、 β-丙氨酸水平显著上升， 与文献报道一致［14］; 与模型组相比， 疏肝健脾方干预 12 周后， 可下调 β-丙氨酸、胞嘧啶的水平，提示其对紊乱的糖、脂肪及蛋白质代谢具有调节作用。

肝脏是物质代谢的枢纽，也是氨基酸代谢的中心器官。 皮下注射 CCl4后， 可产生脂质过氧化作用，导致溶酶体酶大量释放入血，组织蛋白分解加强，部分肝细胞结构破坏，使肝细胞合成蛋白质的功能降低，肝对氨基酸清除率降低，造成氨基酸水平明显升高［15］。 本实验发现， 模型组赖氨酸水平显著升高，给予疏肝健脾方干预后，可下调赖氨酸水平。

综上所述，疏肝健脾方对肝纤维化大鼠具有保护作用，其机制可能与调节能量代谢、嘧啶合成代谢、氨基酸代谢有关。

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Effects of Shugan Jianpi Formula on urine metabonom ic in rats w ith hepatic fibrosis induced by CC l4

JIANG Hui1， WU Fu-rong2， GAO Jia-rong1*， CHEN Jin-feng1

（1.The First Affiliated Hospital of Anhui University of ChineseMedicine， Crade3 Laboratory of Traditional Chinese Medicine Preparation， State Administration of TCM， Hefei 230031， China;2.Department of Pharmacy， Anhui Provincial Hospital， Hefei230001， China）

AIM To study themetabolic changes of Shugan Jianpi Formula（Artemisiae scopariae Herba， BupleuriRadix， AstragaliRadix， Paeoniae Radix alba， Aurantii Fructus， Atractylodismacrocephalae Rhizoma， Polyporus， Poria， Lycopi Herba ） on experimental liver fibrosis in rats and to explore its possible mechanisms. METHODS The rats with liver fibrosiswere induced by subcutaneous injection of50%carbon tetrachloride-olive oil solution.They were assigned to themodelgroup and Shugan Jianpi Formula group.Some other ratswere selected as health control group.All groupswere given lavage for twelve weeks.Themetabolic profile changes of urine samples were analyzed by GC/TOFMS and the resultswere processed by principal component analysis， partial least squares-discriminate analysis， and orthogonal projections to latent structures discriminant analysis.RESULTS Compared with the control group，six significantly changed metabolites， such as 2-hydroxybutanoic acid， isoleucine，beta-alanine acid， cytidine， lysine were identified.As compared with themodel group，Shugan Jianpi Formula group could reverse the levels of thesemetabolites to normal or close to normal levels.CONCLUSION The current study indicates that Shugan Jianpi Formula has significant anti-fibrotic effects on CCl4-induced liver fibrosis in rats， whichmightbe related to regulating the dysfunction of energymetabolism，pyrimidinemetabolism and amino acid metabolism.

Shugan Jianpi Foumula;hepatic fibrosis;metabonomics;GC-TOF/MS

R969.1

:A

1001-1528（2014）12-2457-06

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.12.003

2014-05-28

国家自然科学基金项目 （81102874）

姜 辉 （1980—） ， 男， 硕士， 主管药师， 研究方向: 肝纤维化的中医药防治。 Tel: （0551） 62838553， E-mail:jhanbing@ 163.com

*通信作者: 高家荣 （1964—） ， 男， 硕士， 主任药师， 研究方向: 中药制剂开发。 Tel: （0551） 62838556， E-mail:zyfygjr@163.com