湖南产石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分抑菌活性的比较研究

李 娟， 麻晓雪， 李顺祥， 伍参荣， 陈钰妍

（湖南中医药大学 中药现代化教育厅重点实验室， 湖南 长沙 410208）

湖南产石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分抑菌活性的比较研究

李 娟， 麻晓雪， 李顺祥*， 伍参荣， 陈钰妍

（湖南中医药大学 中药现代化教育厅重点实验室， 湖南 长沙 410208）

目的 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分的体外抑菌活性比较。方法 采用平皿打孔法和二倍稀释法测定各样品的体外抑菌活性。结果 湖南产石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、白假丝酵母菌、乙型溶血性链球菌、幽门螺杆菌等多种致病菌表现出较强的抑制作用，对大肠埃希菌、痢疾志贺氏杆菌的抑制作用较弱，对绿脓杆菌无抑菌活性。石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分的抑菌活性明显强于正丁醇萃取组分和水层部分，其中水菖蒲石油醚和三氯甲烷萃取组分抑制乙型溶血性链球菌，水菖蒲正丁醇萃取组分抑制幽门螺杆菌的作用最强。最低抑菌浓度表明，水菖蒲乙醇提取物、石油醚和乙酸乙酯萃取组分对乙型溶血性链球菌，水菖蒲三氯甲烷和正丁醇萃取组分对幽门螺杆菌均具有显著的抑制作用，最低抑菌质量浓度为 3.13 mg/mL。 结论 石菖蒲和水菖蒲均具有抑菌作用， 尤其是水菖蒲对乙型溶血性链球菌和幽门螺杆菌的抑制作用显著，具有潜在的药用开发价值。

石菖蒲；水菖蒲；乙醇提取物；萃取组分；抑菌活性

石菖蒲为天南星科植物石菖蒲 Acorus tatarinowii Schott.的干燥根茎，具有开窍豁痰，醒神益智，化湿开胃之功效。主治神昏癫痫，健忘失眠，耳鸣耳聋，脘痞不饥，噤口下痢。 主产于四川、 浙江、 江苏、 湖南等地［1］。 水菖蒲为天南星科植物菖蒲 Acorus calamus L.的干燥根茎， 具有化痰开窍，除湿健脾，杀虫止痒之功效。主治痰厥昏迷，中风，癫癎，惊悸健忘，耳鸣耳聋，食积腹痛，痢疾泄泻，风湿疼痛，湿疹，疥疮。主产于湖北、湖南、辽宁、四川等地［2］。 民间在端午节这天挂菖蒲、 薰艾叶、 佩带香囊袋、洗菖蒲浴等以避除秽恶之气、 防病祛疫［3］。 现代药学研究表明，石菖蒲和水菖蒲粗提物和挥发油具有多种生物活性，尤其在抑菌方面［4-9］。 湖南产石菖蒲和水菖蒲资源丰富， 为了了解本地产菖蒲药材的抑菌活性，合理利用和开发本地资源，本研究对石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分的体外抑菌活性进行分析，为石菖蒲和水菖蒲抑菌活性成分的进一步筛选和药用开发提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 仪器、 试剂与材料

1.1.1 主要仪器 SW-CJ-1B型超净工作台 ( 苏州净化设备有限公司)， WAC-47 全自动高压灭菌锅 (北京勤业永为科技有限公司)， 303S-0 型电热恒温培养箱 ( 上海康路仪器设备有限公司)， T-214 电子天平 (北京赛多利斯仪器系统有限公司)， SHZ-D循环水式真空泵 ( 巩义市英峪予华仪器厂)， R-201 旋转蒸发仪 ( 上海申顺生物科技有限公司)。

1.1.2 试剂 普通营养琼脂 (肉汤) 培养基 (杭州微生物试剂有限公司)， 无菌脱纤维羊血 (北京陆桥技术有限公司)， 明胶十六烷三甲基溴化胺培养基 (上海源叶生物科技有限公司)， 其余试剂均为分析纯。

1.1.3 药材 石菖蒲和水菖蒲于 2011 年 12 月采自湖南浏阳大围山，经湖南中医药大学刘塔斯教授鉴定为天南星科植物石 菖 蒲 Acorus tatarinowii Schott和 菖 蒲 Acorus calamus Linn.。 将采收的石菖蒲和菖蒲洗净去泥砂， 取根茎， 阴干，备用。

1.1.4 供试 菌 种及 来 源 金 黄 色 葡 萄 球 菌 Staphylococcus aureus(ATCC25923) ， 大 肠 埃 希 菌 Escherichia coli (ATCC25922)， 绿 脓 杆 菌Pseudomonas aeruginosa (ATCC27853) ， 表 皮 葡 萄 球 菌 Staphylococcus epidermidis (ATCC1228) ， 痢 疾 志 贺 氏 杆 菌 Shigella dysenteriae (ATCC25931) ， 白 假 丝 酵 母 菌Monilia albicans (ATCC10231) ， 乙 型 溶 血 性 链 球 菌 Strptococous hemolyticus (ATCC32210)， 均购于南京便诊生物科技有限公司， 湖南中医药大学医学院病原免疫学实验室保存；幽门螺杆菌Helicobacter pylori为中南大学湘雅附属一医院范学工教授赠送，湖南中医药大学医学院病原免疫学实验室保存。

1.2 方法

1.2.1 石菖蒲和水菖蒲不同提取物的制备 石菖蒲药材粉碎成粗粉， 称取 1 kg， 加 95%乙醇浸提 4 次， 每次 24 h，滤液合并后， 45 ℃减压浓缩至无醇味， 得乙醇提取物。 将乙醇提取物加水溶散后，依次用不同极性的溶剂萃取，得石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇不同萃取组分和水层部分。水菖蒲药材同法处理，依次得乙醇提取物、石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇不同萃取组分和水层部分。 取各样品适量， 加二甲基亚砜 (DMSO)， 用无菌水溶解， 制成质量浓度为 100 mg/mL溶液， 作为供试品溶液。

1.2.2 培养基的制备 普通营养琼脂 (肉汤) 培养基用于金黄色葡萄球菌、大肠杆菌、表皮葡萄球菌和痢疾志贺氏杆菌培养； 普通营养琼脂 (肉汤) 培养基中另加入 8%脱纤维羊血用于乙型溶血性链球菌的培养； Skirrow血琼脂培养基用于幽门螺杆菌培养；明胶十六烷三甲基溴化胺培养基用于绿脓杆菌培养；沙堡氏培养基用于白假丝酵母菌培养。

1.2.3 抑菌活性的测定［10-11］采用打 孔法， 并加以改 进。取无菌试管分别加入2 mL熔融并恒温到58 ℃左右的营养琼脂和 对 数 生 长 期 菌 液 0.1 mL( 菌 液 密 度 1 ×107CFU/mL)， 充分混匀， 立即倒入已制备好的平皿中， 使其均匀铺开，冷凝后用直径6 mm金属灭菌打孔器于平皿中均匀且垂直打孔，挑出琼脂，分别用定量移液器移取供试液100 μL， 及 DMSO溶液做阴性对照， 每个样品重复3 次，每次做平行孔3 孔。 细菌37 ℃培养箱中培养24 h(幽门螺杆菌用 37 ℃微需氧环境 (85%N2， 10%CO2， 5%O2) 培养 72 h)， 真菌 28 ℃培养 48 h 后， 以游标卡尺分别测量每一个抑菌圈两个垂直方向的直径，抑菌环的边缘以肉眼看不到细菌明显生长为限，评价不同样品的抑菌活性。

1.2.4 抑菌能力的测定［12］采用二倍稀释法测定药物的最低抑菌浓度 (MIC)， 每管 1.0 mL液体培养基中分别加入不同质量浓度的试验样品，使各提取物的终质量浓度分别为 100、 50、 25、 12.5、 6.25、 3.13、 1.57、 0.79 mg/ mL， 各管最终总容量为1mL。 另设置加等量不含任何药物M-H液体培养基的正常对照， 含菌不含药 M-H液体培养基的阳性对照。 各实验管分别加入密度 2 ×107CFU/m L的各菌株对数生长期新鲜培养物 0.1 mL， 细菌 37 ℃培养箱中培养24 h ［幽门螺杆菌用37 ℃微需氧环境 (85%N2， 10% CO2， 5%O2) 培养 72 h］， 真菌 28 ℃培养 48 h 后， 肉眼观察不同菌株生长情况，以培养基中没有细菌生长的最高稀释度为 MIC， 初步确定抑菌浓度范围。

2 结果与分析

2.1 石菖蒲和水菖蒲不同提取物的抑菌活性比较 从抑菌圈直径分析，石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分对上述8种供试菌的抑菌圈直径存在很大差异，结果见表1。

表 1 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分的抑菌活性比较 （n=9）

从表1可知，石菖蒲和水菖蒲的不同样品对除绿脓杆菌外的7种供试菌株均表现出明显的抑菌活性，但其抑菌能力和抑菌范围存在差异。由抑菌圈结果可知，不同样品对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌的抑菌作用明显强于革兰阴性菌大肠埃希菌和痢疾杆菌，并且对幽门螺杆菌和真菌白假丝酵母菌也有较强的抑制作用。其中，通过抑菌圈直径比较，水菖蒲石油醚和三氯甲烷萃取组分抑制乙型溶血性链球菌，水菖蒲正丁醇萃取组分抑制幽门螺杆菌的活性最好，所有样品对大肠埃希菌、痢疾志贺氏杆菌和绿脓杆菌的抑制作用较差。

石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物和石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分的抑菌活性明显强于正丁醇萃取组分和水层部分。不同药材采用同种提取方法所得样品在抑制同种菌种中比较可知，石菖蒲乙醇提取物和石油醚萃取组分的抑菌活性:幽门螺杆菌 ＞表皮葡萄球菌 ＞乙型溶血性链球菌＞金黄色葡萄球菌 ＞白假丝酵母菌 ＞痢疾杆菌＞大肠埃希菌＞绿脓杆菌， 水菖蒲乙醇提取物 (石油醚萃取组分)抑菌活性:乙型溶血性链球菌 ＞表皮葡萄球菌 ＞幽门螺杆菌＞白假丝酵母菌＞金黄色葡萄球菌 (金黄色葡萄球菌 ＞白假丝酵母菌)＞痢疾杆菌 ＞大肠埃希菌， 并且石菖蒲乙醇提取物抑制金黄色葡萄球菌和幽门螺杆菌，石菖蒲石油醚萃取组分抑制痢疾杆菌和大肠埃希菌的作用显著强于水菖蒲的；水菖蒲乙醇提取物抑制乙型溶血性链球菌，水菖蒲石油醚萃取组分抑制表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的作用显著强于石菖蒲的。石菖蒲 (水菖蒲) 三氯甲烷萃取组分抑菌活性: 表皮葡萄球菌 (乙型溶血性链球菌)＞幽门螺杆菌 ＞乙型溶血性链球菌 (表皮葡萄球菌)＞金黄色葡萄球菌＞白假丝酵母菌 ＞大肠埃希菌 ＞痢疾杆菌， 水菖蒲三氯甲烷萃取组分抑制乙型溶血性链球菌、表皮葡萄球菌、幽门螺杆菌、白假丝酵母菌和金黄色葡萄球菌的作用显著强于石菖蒲的。石菖蒲 (水菖蒲) 乙酸乙酯萃取组分抑菌活性:乙型溶血性链球菌＞幽门螺杆菌 ＞表皮葡萄球菌＞金黄色葡萄球菌＞白假丝酵母菌＞痢疾杆菌 (大肠埃希菌)＞大肠埃希菌 (痢疾杆菌)。 石菖蒲乙酸乙酯萃取组分抑制金黄色葡萄球菌、痢疾杆菌和白假丝酵母菌的作用显著强于水菖蒲的。 石菖蒲 (水菖蒲) 正丁醇萃取组分抑菌活性:幽门螺杆菌 ＞表皮葡萄球菌 ＞乙型溶血性链球菌＞白假丝酵母菌＞金黄色葡萄球菌＞大肠埃希菌 (痢疾杆菌)＞痢疾杆菌 (大肠埃希菌)， 并且水菖蒲正丁醇萃取组分抑制表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和幽门螺杆菌的作用显著强于石菖蒲的。 石菖蒲 (水菖蒲) 水层部分抑菌活性:幽门螺杆菌 ＞白假丝酵母菌 ＞乙型溶血性链球菌 ＞表皮葡萄球菌 (金黄色葡萄球菌)＞金黄色葡萄球菌 (表皮葡萄球菌)＞大肠埃希菌 ＞痢疾杆菌， 并且两者的抑菌活性无显著性差异。

2.2 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分的最低抑菌质量浓度 从表2可知，石菖蒲和水菖蒲不同样品对革兰阳性菌金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌以及对革兰阴性菌幽门螺杆菌的 MIC范围 3.13 ～12.50 mg/m L， 对白假丝酵母菌的 MIC 12.50 mg/mL。 其中， 水菖蒲的乙醇提取物、石油醚、乙酸乙酯萃取组分对乙型溶血性链球菌，水菖蒲三氯甲烷萃取组分对幽门螺杆菌均具有显著的抑制作用， 最低抑菌质量浓度为 3.13 mg/m L， 当不同样品的质量浓度为 12.5 mg/mL时， 均能抑制上述5 种供试菌株的生长。

3 结论

预实验中对两种药材的乙醇浸提物和浸提后药渣水煎煮液进行抑菌活性比较，发现水煎煮液的抑菌活性较弱，说明抑菌活性物质主要集中在脂溶性成分，并参考相关文献［9，13-15］， 石菖蒲和水菖蒲 采用乙醇浸提， 既 提 取出脂溶性的成分，又避免因加热引起的成分不稳定，因此，本实验采用 95%乙醇浸提。

湖南产石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分对金黄色葡萄球菌、表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌、幽门螺杆菌和白假丝酵母菌等多种致病菌表现出较强的抑制作用，对大肠埃希菌和痢疾杆菌的抑制作用较弱，对绿脓杆菌无抑菌活性。石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物和石油醚、三氯甲烷、乙酸乙酯萃取组分的抑菌活性明显强于正丁醇萃取组分和水层部分。其中，通过抑菌圈直径比较，水菖蒲石油醚和三氯甲烷萃取组分抑制乙型溶血性链球菌，水菖蒲正丁醇萃取组分抑制幽门螺杆菌的作用最强。不同药材采用同种提取方法所得样品在抑制同种菌种中比较可知，石菖蒲乙醇提取物抑制金黄色葡萄球菌和幽门螺杆菌，石油醚萃取组分抑制痢疾志贺氏杆菌和大肠埃希菌的活性强于水菖蒲；水菖蒲乙醇提取物抑制乙型溶血性链球菌，石油醚萃取组分抑制表皮葡萄球菌和乙型溶血性链球菌的活性明显强于石菖蒲；水菖蒲三氯甲烷萃取组分抑制乙型溶血性链球菌、表皮葡萄球菌、幽门螺杆菌、白假丝酵母菌和金黄色葡萄球菌的活性明显强于石菖蒲；石菖蒲乙酸乙酯萃取组分抑制金黄色葡萄球菌、痢疾志贺氏杆菌和白假丝酵母菌的活性明显强于水菖蒲；水菖蒲正丁醇萃取组分抑制表皮葡萄球菌、乙型溶血性链球菌和幽门螺杆菌的活性明显强于石菖蒲。最低抑菌浓度实验表明，水菖蒲的乙醇提取物和石油醚、乙酸乙酯萃取组分对乙型溶血性链球菌，三氯甲烷萃取组分对幽门螺杆菌均具有显著的抑制作用， 最低抑菌质量浓度为 3.13 mg/mL， 当不同样品的质量浓度为12.5mg/mL时， 均能抑制金黄色葡萄球菌、 表皮葡萄球菌、白假丝酵母菌、乙型溶血性链球菌和幽门螺杆菌的生长。

表 2 石菖蒲和水菖蒲乙醇提取物及其萃取组分的 M IC

实验证明石菖蒲和水菖蒲均具有抑菌作用，尤其是水菖蒲的乙醇提取物和石油醚、三氯甲烷萃取组分对乙型溶血性链球菌，水菖蒲三氯甲烷、正丁醇萃取组分对幽门螺杆菌的抑制作用非常显著，为进一步筛选抑菌活性成分提供依据。

中药抗菌相对于西药而言，是从整体水平发挥抗感染效应，许多药物在抗感染的同时兼有解热和消炎的作用，具有疗效确切、副作用小、较少出现耐药性等特点，因此，从具有抑菌活性的石菖蒲和水菖蒲中获得抑菌活性物质，对中药抑菌药物的开发，有着非常积极的作用。

［ 1 ］ 国家药典委员会.中华人民共和国药典:2010 年版一部［S］.北京: 中国医药科技出版社， 2010:85.

［2］ 国家中医药管理局 《中华本草》 编委会.中华本草: 第八册 ［M］.上海: 上海科学技术出版社， 1999:468-478.

［ 3 ］ 余 力.漫谈我国端午节的药俗［J］.东方食疗与保健，2008(5):5-6.

［ 4 ］ Deng Yecheng， Chen Kailin， Yu Yanzhen， etal.In vitro antifungal activity of the extract and compound from Acorus tatarinowii against seven plant pathogenic fungal［ J］.Agricul Sci Chin， 2010， 9(1):71-76.

［5］ 邓业成，玉艳珍，王萌萌.石菖蒲提取物及其初步分离物的抑菌活性研究［J］.安徽农业科学， 2010， 38(15):7836-7838， 7875.

［6］ 张 梅，康晓慧，马 林.五种药用植物提取液抑菌作用研究［J］.湖北农业科学， 2011， 50(4):728-730.

［ 7 ］ Devi SA， Ganjewala D.Antimicrobial activity of Acorus calamus(L.)rhizome and leaf extract［ J］.Acta Biologica Szegediensis， 2009， 53(1):45-49.

［ 8 ］ Singh S， Srivastava R， Choudhary S.Antifungal and HPLC analysis of the crude extracts of Acorus calamus， Tinospora cordifolia and Celestrus paniculatus［ J］ .J Agrci Technol， 2010， 6 (1):149-158.

［ 9 ］ Kim W J， Hwang K H， Park D G， etal.Major constituents and antimicrobial activity of Korean herb Acorus calamus［ J］ .Nat Prod Res， 2011， 25(13):1278-1281.

［10］ 陈 奇.中药药效学研究［M］.北京: 人民卫生出版社，2006:274-276.

［11］ 张岳文， 王敏丽， 聂 芸.宣木瓜不同部位营养成分的动态变化［J］.食品工业科技， 2011， 32(12):90-92.

［12］ 徐叔云， 卞如濂， 陈 修.药理实验方法学［M］.3 版.北京: 人民卫生出版社， 2002:1657.

［13］ 董玮玮.水菖蒲的化学成分研究和忍冬属植物的色谱分析［D］.成都: 中国科学院成都生物研究所， 2009.

［14］ 朱梅菊， 谭宁华， 稽长久， 等.石菖蒲乙醇提取物石油醚部分化学成分的研究［J］.中国中药杂志， 2010， 35(2): 173-175.

［15］ Phongpaichit S， Pujenjob N， Rukachaisirikul V， et al.Antimicrobial activities of the crudemethanol extract of Acorus calamus Linn.［ J］ .JSci Technol， 2005， 27(2):517-523.

R284.2

:B

:1001-1528(2014)02-0393-04

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.041

2013-03-04

国家中医药管理局 “药用植物学” 重点学科课题 (国中医药发 ［2009］ 30 号)， 湖南省高校科技创新团队 (湘教通［2010］ 212 号)， 湖南中医药大学研究生创新课题 (校行研字 ［2012］ 4 号)

李 娟 (1979—) ， 女， 助理研究员， 研究方向: 中药物质基础与作用机制。 E-mail:Forever-lijuan@163.com

*通信作者: 李顺祥， 博士生导师， 研究员， 研究方向: 中药有效成分与资源。 E-mail:lishunxiang@hotmail.com