薏苡仁脂肪酸类成分对人肝癌细胞株 SMMC-7721 细胞周期及细胞凋亡的影响

包永睿， 王 帅， 孟宪生*， 巩晓杰， 杨欣欣

（1.辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连 116600； 2.辽宁省组分中药工程技术研究中心， 辽宁 大连116600； 3.辽宁省现代中药研究工程实验室， 辽宁 大连 116600）

薏苡仁脂肪酸类成分对人肝癌细胞株 SMMC-7721 细胞周期及细胞凋亡的影响

包永睿1，2，3， 王 帅1，2，3， 孟宪生1，2，3*， 巩晓杰1， 杨欣欣1，2，3

（1.辽宁中医药大学药学院， 辽宁 大连 116600； 2.辽宁省组分中药工程技术研究中心， 辽宁 大连116600； 3.辽宁省现代中药研究工程实验室， 辽宁 大连 116600）

目的 研究薏苡仁脂肪酸类成分对人肝癌细胞株 SMMC-7721 增值的影响及作用机制初探。 方法 采用 MTT法考察不同给药剂量， 不同给药时间下薏苡仁脂肪酸类成分对 SMMC-7721 细胞的增值抑制作用及其与时间、 剂量的关系； 碘化丙啶 PI单染色法检测薏苡仁脂肪酸作用后， SMMC-7721 细胞周期 DNA水平变化； Annexin V-EGFP/PI双染法研究薏苡仁脂肪酸对 SMMC-7721 细胞凋亡 率的影响。 结果 不 同质量浓度 的薏苡 仁脂肪 酸 作用 SMMC-7721 细胞24、 48、 72 h 后， 均呈现出较好的细胞增殖抑制作用， 且具有明显的时间-剂量-效应关系， 差异有统计学意义 (P＜0.05)； 不同质量浓度的薏苡仁脂肪酸处理 SMMC-7721 细胞 22 h 后可显著增加肝癌细胞凋亡率， (P＜0.001)； 作用36 h 后， 可显著降低 G2/M期细胞比例， (P＜0.001)。 结论 薏苡仁脂肪酸对人肝癌 SMMC-7721 细胞具有明显的抑制作用并可诱导其凋亡， 其作用是通过抑制 G2/M细胞周期实现的。

薏苡仁脂肪酸类； 人肝癌 SMMC-7721 细胞株； 细胞周期； 细胞凋亡

薏苡仁为 禾 本 科植物薏苡 Coix lacryma-jobi L. var.mayuen(Roman.)Stapf的干 燥 成 熟种仁， 味甘、淡，性凉；归脾、胃、肺经；具有利水渗湿、健脾止泻、除痹、排脓、解毒散结的功效，用于水肿、脚气、小便不利、脾虚泄泻、湿痹拘挛、肺痈、肠痈、 癌肿等［1］。 薏苡仁中含有多种活性成分，主要包括薏苡仁酯、甘油三酯类、脂肪酸类、内酰胺类、薏苡内酯、 糖类、 甾醇类、 三萜类等化合物［2-5］。

根据文献调研结果，发现薏苡仁脂肪酸类成分的抗肿瘤活性报道较多，但其抗肝脏等恶性肿瘤作用机制研究较少。本实验是在前期薏苡仁脂肪酸类成分富集、 解析研究工作 基础上［6-7］， 即药 效物质成分构成基本明确的基础上， 采用 MTT法对薏苡仁脂肪酸类成分进行体外抗肝脏肿瘤实验，发现富集到的薏苡仁脂肪酸类成分具有明显的抑制肿瘤活性。在此研究基础上， 进一步采用流式细胞仪 PI染色法和 Annexin V-EGFP/PI双染法研究薏苡仁脂肪酸类成分对人肝癌细胞株 SMMC-7721 细胞周期及细胞凋亡的影响， 探讨其对 SMMC-7721 肿瘤细胞的作用机制，为今后开展治疗原发性肝癌创新药物的研究开发奠定基础。

1 材料

1.1 细胞株 人肝癌 SMMC-7721 细胞 (上海复蒙生物有限公司， 培养于含胎牛血清的DMEM培养液中)。

1.2 主要药材 薏苡仁脂肪酸类成分 (辽宁中医药大 学 分 析 测 试 中 心 自 制［6］)； 环 磷 酰 胺 片(CTX)(南通精华制药有限公司)； 胎牛血清 (美国 Hyclone公司)； 细胞周期与细胞凋亡检测试剂盒 (碧云天生物技术有限公司)； Annexin V/PI双染色试剂盒 (南京凯基生物技术有限公司)；DMEM培养基与胰蛋白酶 (美国 Gibco公司)； 超纯水 ( 由 Milli-Q纯水系统制得)［8-9］。

1.3 主要仪器 流式细胞仪 (美国 BD公司)；CO2培养箱 ( 德国 NuAire公司)；酶 标仪 ( 瑞士Tecan 公司)； 电子天平 (德国赛多利斯集团)； 倒置相差显微镜 (德国麦克奥迪公司)。

2 方法

2.1 薏苡仁脂肪酸类成分体外药效学检测［8-9］

2.1.1 细胞培养 人肝癌 SMMC-7721 细胞复苏后， 按贴 壁 细胞培养法， 以 细 胞 计 数 5 ×105个/m L培养于含体积分数为 10%胎牛血清的 DMEM培养液中，每两天传代一次，取对数生长期细胞进行实验， 培养条件为 37 ℃、 5%CO2、饱和湿度。

2.1.2 细胞增殖抑制实验 (MTT法) 取对数生长 期 的 细 胞， 0.25% 胰 酶 消 化 后， 以 5 ×104(个/mL)细胞数接种于 96 孔培养板。 分别设试验组、空白对照组和空白调零组 (只加培养基，不加细胞)。 培养 24、 48、72 h 后， 每孔加入 5 mg/mL MTT溶液20 μL， 4 h 后吸弃上清液， 加入 150 μL DMSO， 震荡溶解紫色结晶， 酶标仪 492 nm波长下测定吸光度 (OD)； 计算细胞增值抑制率［8，10-12］。

2.1.3 统计学分析 采用 S PSS 16.0 软件单因素方差分析进行多组间比较，结果用表示， P＜0.05 为有显著性差异，同时计算 I C50值。

2.2 薏苡仁脂肪酸类成分对 S MMC-7721 细胞株细胞周期的影响

2.2.1 药物制备与分组 精密量取薏苡仁脂肪酸类成分 1 mL， 加 0 .5%CMC-Na 5 μL， 用培养液配制成质量浓度为 6 2.5 μL/mL的贮备液作为高剂量组；再按比例稀释成质量浓度为 1 5.63 μL/mL的溶液作为低剂量组， 0.22 μm微孔滤膜过滤， 备用。

2.2.2 细胞周期的检测 (碘化丙啶 P I单染法)取对数生长期细胞，常规培养至细胞计数为1× 107个/瓶， 分别加入 6 2.5 μL/m L， 15.63 μL/mL薏苡仁药液， 空白对照组加入含 0 .5%CMC-Na的等体积培养液，36 h 后收集细胞。 用冷 P BS 液洗涤细胞2 次后， 加入预冷的 7 0%乙醇 4 ℃下固定12 h， 再用 P BS 液洗涤细胞1 次。 每组细胞样品中加入0.5 mL PI染色液， 混悬， 37 ℃避光温浴 3 0 min， 流式细胞仪 4 88 nm处检测， ModFit细胞周期拟和软件分析［8-9，13-15］。

2.3 薏苡仁脂肪酸类成分对 S MMC-7721 细胞株细胞凋亡的影响

2.3.1 药物制备与分组 精密量取薏苡仁脂肪酸类成分 1 mL， 加 0 .5%CMC-Na 5 μL， 用培养液配制成质量浓度为 31.25 μL/mL的贮备液作为高剂量组； 再 按 比 例 稀 释 成 质 量 浓 度 为 15.63、 7.81 μL/mL的溶液作为中、 低剂量组， 0.22 μm微孔滤膜过滤，备用。

2.3.2 细胞凋亡的检测 (Annexin V-EGFP/PI双染色法) 取对数生长期细胞接种于6孔板中，细胞计数为 1 ×105个/孔， 24 h 后，每孔加入 1 mL不同组别药物，对照组1加入等体积培养液，对照组2加入等体积 0.5%DMSO水溶液， 分别培养 22、 46 h后， 收集细胞， 用冷 PBS 洗涤细胞 2 次后， 加入Binding Buffer 500 μL， 悬浮细胞， 然后再分别加入5 μL的 AnnexinV-EGFP和 Propidium Iodide， 混匀，室温避光反应 5 ～15 min， 在 1h 内， 用流式细胞仪Cell Quest软件分析细胞凋亡情况［8-9，16-18］。

2.4 统计学分析 采用 SPSS16.0 软件进行 t检验分析，结果用表示；P＜0.05，0.01， 0.001表示差异有统计学意义。

3 结果

3.1 薏苡仁脂肪酸类成分对 SMMC-7721 细胞株的增殖抑制作用 6.25 ～200 μL/mL薏苡仁脂肪酸类成分， 作用 SMMC-7721 细胞 24、 48、 72 h 后， 对细胞的增殖抑制作用结果见表1。

表 1 薏苡仁脂肪酸类成分对 SMMC-7721 细胞株生长曲线的影响 （n=6）Tab.1 Fatty acid com position from coicis semen im pacting the grow th curve line of human hepatoma SMMC-7721 cell（n=6）

由表 1 可知， 薏苡仁脂肪酸类成分对 SMMC-7721 细胞抑制作用显著， 随着药物质量浓度与作用时间的增加与延长，细胞抑制率逐渐增加，表现出了较好的剂量-效应关系， 不同给药时间下均在给药剂量为 100 μL/m L时效果最好。 从给药时间上看， 给药 72 h 各组表现出较好的抑制率， IC50随时间的延长逐渐降低，说明薏苡仁脂肪酸类成分体外起效具有一定的时间-效应关系。

3.2 薏苡仁脂肪酸类成分对 SMMC-7721 细胞株细胞周期的影响 由表 2、 图 1 可知，在 G0/G1期，给药组与空白组比较 DNA水平均有所增加， 高、低剂量组较空白组均有显著性差异 (P＜0.01)； S期， 给药组与空白组比较， 含有量差异不大； G2/ M期， 给药组与空白组比较 DNA水平明显降低，高、低剂量组较空白组均有显著性差异 (P＜0.001)。 说明薏苡仁提取物能造成 SMMC-7721 细胞 G2/M期阻滞， 从而影响细胞周期正常进行。

表2 薏苡仁脂肪酸类成分作用于细胞后细胞周期 DNA水平变化Tab.2 Fatty acid composition from coicis semen changing content of DNA in the after cell cycle

3.3 薏苡仁脂肪酸类成分对 SMMC-7721 细胞株细胞凋亡的影响 由图2、 表3可知， 当药物作用细胞22、 46 h 后， 3 个给药组与对照组比较， 早期凋亡比例与凋亡总比例均有显著差异；另外，药物作用 46h 后的细胞， 晚期凋亡比例也出现了显著差异。随着药物浓度与作用时间的增高和延长，细胞凋亡率也随之增大。表明薏苡仁脂肪酸类成分促进SMMC-772 l细胞凋亡作用明显， 尤其是作用 22h 后的早期凋亡，说明薏苡仁脂肪酸诱导细胞凋亡主要作用在早期。

4 讨论

肝癌是临床上最常见的恶性肿瘤之一。全球发病率逐年增长， 已超过 62.6 万/年， 据统计， 每年因肝癌死亡人数接近60万人， 居于恶性肿瘤的第五位。目前我国发病人数约占全球的半数以上，已经成为严重威胁我国人民健康和生命的一大杀手［19-20］。

图1 薏苡仁脂肪酸类成分细胞周期分布图Fig.1 Cell cycle distribu tion icon of fatty acid com position from coicis semen

图 2 Annexin V-EGFP/PI双染检测薏苡仁脂肪酸类成分诱 导 SMMC-7721 细胞凋亡Fig.2 Detecting SMMC-7721 apoptosis induced by the fatty acid com position from coicis semen through the method of Annexin V-EGFP/PI double staining

表3 不同时间不同剂量薏苡仁脂肪酸类成分对细胞凋亡率的影响Tab.3 Effect on rate of apoptosis of different doses of from soisis semen fatty acid in different times

本实验前期对薏苡仁脂肪酸类成分开展了分离富集、成分分析研究，得到的薏苡仁脂肪酸类成分主要由三亚油酸甘油酯、二亚油酸甘油酯、棕榈酸二亚油酸甘油酯、亚油酸二油酸甘油酯、棕榈酸亚油酸油酸甘油酯、二棕榈酸亚油酸甘油酯、甘油三油酸酯、棕榈酸二油酸甘油酯、二棕榈酸油酸甘油酯、 二油酸硬脂酸甘油酯等成分组成［6］。

本研究发现， 该成分对人肝癌 SMMC-7721 细胞株具有明显的增殖抑制作用。进一步的细胞周期与细胞凋亡实验表明，薏苡仁脂肪酸类成分可诱导SMMC-7721 细胞凋亡， 且随着作用时间的延长，晚期凋亡比例逐渐上升，这种诱导效应呈现出明显的时间-剂量-效应关系。 薏苡仁脂肪酸类成分对细胞周期的作用是通过抑制 G2/M细胞周期实现的。

本实验研究说明薏苡仁脂肪酸类组分对人肝癌SMMC-7721 细胞的作用机制是通过诱导 SMMC-7721 细胞早期凋亡， 抑制 G2/M细胞周期， 从而达到治疗肝肿瘤的作用，该研究为研制抗肝癌现代新药提供方向。

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Effect of Semen coicis fatty acid on cell cycle and apoptosis induction of human hepatom a cell line SMMC-7721

BAO Yong-rui1，2，3， WANG Shuai1，2，3， MENG Xian-sheng1，2，3*， GONG Xiao-jie1， YANG Xin-xin1，2，3
(1.College of Pharmacy， Liaoning University of Traditional Chinese Medicine， Dalian 116600， China； 2.Liaoning Provincial Multi-component Chinese Medicine Engineering Technology Research Center， Dalian 116600， China； 3.Liaoning Provincial Modern Traditional ChineseMedicine Research and Engineering Laboratory， Dalian 116600， China)

AIM To investigate the inhibitory effect of fatty acid from coicis semen on human hepatoma cell line SMMC-7721.METHOD MTTmethod was used to evaluate the inhibitory rate and time-doses relationship of fatty acid on SMMC-7721 with different doses and delivery times.Flow cytometry PI stainingmethod was used to measure the changes of DNA content and Annexin V-EGFP/PI double staining method was used for the apoptotic rate in SMMC-7721.RESULTS Experiment data showed significant cell proliferous inhibition with obvious timedose-effect relationship with significant difference(P＜0.05)， after 24， 48，72 h of incabation of SMMC-7721 with different concentrations of fatty acid from coicis semen.Incubation of SMMC-7721 with different concentrationsof fatty acid from coicis semen for 22 h and 36 h significantly increased the liver cell apoptostic rate， (P＜0.001) ， and reduced the G2/M phase cell proportion with statisticalmeanings(P＜0.001) ， respectively.CONCLUSION The fatty acid from coicis semen can inhibit the hepatoma cell line SMMC-7721 in vitro by inhibiting cell proliferation and inducing cell apoptosis by inhibiting G2/M phase cell proportion.

fatty acid from coicis semen； Human hepatoma SMMC-7721cell line； cell cycle； cell apoptosis

R285.5

:A

:1001-1528(2014)02-0235-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.02.004

2013-02-20

国家 “ 重大新药创制” 科技重大专项 (2010ZX09401-304-105C)

包永 睿 (1978—) ， 男， 硕 士， 主 要 从 事 中 药 质 量 分 析 及 作 用 机 制 研 究 工 作。 Tel:(0411)87406496， E-mail:byr1026 @163.com

*通信作者: 孟宪生 (1964—)， 男， 教授， 博 士， 主要 从事 从事中 药组 分配伍、 代谢 组学 及药品 质量 分析工 作。 Tel:(0411) 87406496， Email:mxsvvv@126.com