黄药子体外抗胃癌活性成分的筛选及分析

2014-04-11李春峰邱军强苗晶囡刘树民

中成药 2014年2期

关键词：扶桑甾醇石油醚

李春峰，邱军强，苗晶囡，张翀，张宁，刘树民*

（1.哈尔滨医科大学附属第三医院胃肠外科，黑龙江哈尔滨 150000； 2.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨 150040）

黄药子体外抗胃癌活性成分的筛选及分析

李春峰1，2，邱军强2，苗晶囡2，张翀2，张宁2，刘树民2*

（1.哈尔滨医科大学附属第三医院胃肠外科，黑龙江哈尔滨 150000； 2.黑龙江中医药大学中医药研究院，黑龙江哈尔滨 150040）

目的通过 MTT体外实验观察黄药子 4 种不同提取物及从石油醚提取物中分离得到的黄独乙素和 β-扶桑甾醇作用于 MGC803、 BGC823 和 SGC7901 3 种人胃癌细胞株，探讨黄药子不同提取物及两个单体对3 种胃癌细胞株的增殖情况的影响，从而筛选出黄药子有效抗胃癌活性成分。方法采用 MTT法检测 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10、 12 mg/mL的不同质量浓度的黄药子石油醚萃取物、乙酸乙酯萃取物、水层萃取物、醇提物和最终质量浓度为 1 ×10-4、 5 × 10-4、 1 ×10-3、 5 ×10-3、 1 ×10-2、 5 ×10-2、 1 ×10-1、 5 ×10-1mg/mL的黄独乙素和 β-扶桑甾醇分别作用于 MGC 803、 BGC823 和 SGC 7901 细胞株 24 h 后对细胞增殖的影响。结果石油醚萃取物、醇提物、黄独乙素和 β-扶桑甾醇均有不同程度的抑制肿瘤细胞生长的作用，而乙酸乙酯萃取物和水萃取物低剂量有不同程度的促进肿瘤细胞生长的作用；大剂量表现为抑制肿瘤细胞生长的作用。结论从石油醚提取物中分离得到的黄独乙素和 β-扶桑甾醇对胃癌细胞均有抑制作用。

黄药子；黄独乙素； β-扶桑甾醇；癌； MGC803； BGC823； SGC7901

黄药子为薯蓣科植物黄独 Dioscorea bulbifera L.的块茎，又名黄药根、铁秤砣等。药性寒味苦，有毒，归肺、肝经。具有化痰散结、消瘿止瘤、清热解毒、凉血止血、抗癌的功效，其药用价值较高，历代本草对其治疗瘿疾、血证、外科诸证的良效均有详尽记载［1-6］。近些年黄药子的抗肿瘤功效逐渐被大家重视，其对 S180( 小白鼠肉瘤)、U14( 宫颈癌) 、 H22( 小鼠肝癌) 等均有抑制作用［7-9］。黄药子的化学成分研究表明，其干燥茎块中含有多种糖类、甾体皂苷和皂苷元、黄独素等，从黄药子中提取的不同成分按一定方式重组后抗癌疗效高于传统的酒泡［10-15］。其中黄药子 A， B， C以及薯蓣皂苷等均具有抗肿瘤作用。

本实验采用 MTT法观察黄药子 4种不同提取物对 3种胃癌细胞株增殖抑制情况，分析不同提取物化学成分对于胃癌细胞的影响。进而发现石油醚提取物对肿瘤细胞的增殖有较好的抑制作用，将从石油醚提取物中分离得到的黄独乙素和 β-扶桑甾醇分别采用 MTT法观察二者对肿瘤细胞的抑制作用。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 药品和细胞株黄药子为市售中药饮片，购自哈药集团世一堂饮片厂。经黑龙江中医药大学中药研究院付克教授鉴定，所购中药饮片为薯蓣科植物黄独 Dioscorea bulbifera L.的块根。实验用胃癌细胞株 MGC 803、 BGC823 和SGC 7901 由哈尔滨医科大学肿瘤医院惠赠，在黑龙江中医药大学中医药研究院细胞室传代备用。

1.1.2 试剂四甲基偶氮唑蓝 (MTT)(Sigma公司产品)， RPMI1640 培养基、胰蛋白酶、胎牛血清、青霉素-链霉素溶液 (赛默飞世尔生物化学制品有限公司产品)。

1.1.3 黄药子石油醚、乙酸乙酯、水和乙醇提取物的制备

准确称取黄药子饮片 1 kg，粉碎过 60 目筛，将药粉用95%乙醇回流提取得总浸膏 112.7 g，并作为乙醇提取物，出膏率为 11.3%。乙醇提取物经石油醚萃取 4 次合并萃取液浓缩干燥得到略带清香味的暗黄色固体，得率 0.34%，称石油醚提取物。石油醚萃取后分别用乙酸乙酯、水按极性依次萃取得各提取物，得率分别为 1.31%、 2.64%。黄独乙素和 β-扶桑甾醇为石油醚提取物分离得到，实验时将各提取物及单体用优级纯 DMSO和无菌水 (20 ∶80) 配成所需质量浓度后备用。

1.1.4 实验仪器 KDC-160HR型高速冷冻离心机 ( 科大创新股份有限公司) ， MP-501A超级恒温箱， MK-3 型酶标仪、超低温冰箱 (赛默飞世尔仪器有限公司)， HZQ-C型空气浴振荡器、 DL-CJ-WD型医用型洁净工作台 ( 哈市东联电子技术开发有限公司)， HF-90 型二氧化碳培养箱 (力康发展有限公司) ， CKX-41-SF型倒置显微镜 ( 美国 philippines公司)，超纯水机 (密理博上海贸易有限公司)。

2 实验部分

MTT法测定 3 种细胞生长抑制率［16-19］选择对数生长期胃癌细胞，调整细胞计数为 1 ×105个/L接种于 96 孔板，每孔 100 μL，每个质量浓度设 6 孔重复，边缘空白孔加100 μL PBS 保持湿度，设定空白对照只加培养基和溶剂，对照组加细胞培养基并给予溶剂。实验组分别给予各提取物终质量浓度为 0.5、 1、 2、 4、 6、 8、 10 和 12 mg/mL的不同提取物和最终计数分别为 1 ×10-4、 5 ×10-4、 1 × 10-3、 5 ×10-3、 1 ×10-2、 5 ×10-2、 1 ×10-1、 5 ×10-1mg/mL的黄独乙素和 β-扶桑甾醇，培养 24 h 后，每孔分别加入 10 μL MTT 37 ℃ 孵育 4 h，吸取上清，加入 100 μL DMSO在平板摇床微振荡 20 min 后，用酶标仪在波长 570 nm处检测每孔吸光度 (A)，计算细胞生长抑制率(%)=1-(A实验-A本底)/(A对照-A本底) ×100%。

3 结果及分析

3.1 提取物对 3 种胃癌细胞株的生长抑制情况将接种于96 孔板的胃癌细胞株 MGC803、 BGC823 和 SGC7901 正常培养 24 h 后，加入不同提取物继续培养 24 h 观察细胞的存活率，发现 0.5 mg/mL石油醚提取物作用于细胞株 BGC823和 SGC 7901 的抑制率分别是42.1%和60.2%，而2mg/mL的石油醚提取物作用于细胞株 MGC803 的抑制率约为61%，与对照组比均有显著性差异 (P＜0.05)，见图 1。

图1 石油醚提取物对3种胃癌细胞的抑制作用（n=3， ¯）

0.5 mg/m L乙醇提取物作用于胃癌细胞株 MGC 803 抑制率 48.0%，与对照组比有极显著性差异；作用于细胞株SGC 7901 抑制率为 49.0%，与对照组比有显著差异 (P＜0.01)，见图 2。

乙酸乙酯提取物作用于细胞株 MGC803 细胞在低剂量表现为促生长作用，质量浓度为 1 mg/mL时有促生长作用，促生长率为 29.6%，且与对照组相比有显著性差异(P＜0.05)；水提取物作用于细胞株 MGC 803 质量浓度为1 mg/mL时促生长率为 43.9%，与对照组相比有显著性差异 (P＜0.05)； 6mg/mL的乙酸乙酯提取物作用于细胞株SGC 7901 表现为抑制生长，抑制率为 13.6%且有显著性差异 (P＜0.05)，见图 3。

图2 乙醇提取物对 3种胃癌细胞的抑制作用（n=3， ¯）

图3 乙酸乙酯提取物对 3种胃癌细胞的抑制作用（ n=3， ¯）

4 mg/mL水提取物作用于细胞株 SGC 7901 表现为抑制生长，抑制率达 15.9%，与对照组相比有显著性差异(P＜0.01)，见图 4。

图4 水提取物对3种胃癌细胞的抑制作用（ n=3， ¯）

3.2 黄独乙素和 β-扶桑甾醇对 3 种胃癌细胞株增殖的抑制作用加入黄独乙素和 β-扶桑甾醇继续培养 24 h，发现不同质量浓度的黄独乙素对胃癌细胞株胃癌细胞株 BGC823和 SGC7901 的抑制率较低，且随质量浓度加大抑制率变化不大，而对胃癌细胞株 MGC803 的抑制作用较强，且随质量浓度变化抑制率逐渐增强，见图 5； β-扶桑甾醇对于胃癌细胞株 BGC823 和 SGC7901 在 1 ×10-4mg/mL抑制作用显著，与对照组相比差异显著；对胃癌细胞株 MGC803 的增殖抑制作用较小，见图6。

图5 黄独乙素对3种胃癌细胞株增殖的影响

图 6 β-扶桑甾醇对 3 种胃癌细胞株增殖的影响

4 讨论

随着现代社会肿瘤患者的增多，西药毒副作用大，同时传统的中医药在国际上的认可度的提高，从天然药用植物中发现新的抗癌的药物的兴趣正逐步显示出来，开发抗肿瘤效果好且毒副作用低的传统中药亟需解决。本实验通过体外培养 MGC 803、 BGC823 和 SGC 7901 3 种胃癌细胞株，研究黄药子不同提取物的抗肿瘤作用，发现石油醚提取物和乙醇提取物抑制肿瘤生长的效果最好，且与剂量呈一定的线性关系，与文献［20］报道一致，同时也验证了黄药子作为传统中药对胃癌有显著疗效。同时发现从石油醚提取物中分离得到的黄独乙素和 β-扶桑甾醇对胃癌细胞株的增殖均有不同程度的抑制作用，同时首次在黄药子中分离得到的甾醇类 β-扶桑甾醇的抗癌作用显著，二萜内酯类黄独乙素的抗癌作用较弱。石油醚提取物发挥抗肿瘤药理作用可能是其含有的薯蓣皂苷元和二萜内酯类成分发挥作用［21-27］，为黄药子抗肿瘤作用提供了一定的依据。为下一步开展黄药子活性成分抗肿瘤作用机制的研究探讨提供基础。

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