GC法测定小鼠灌胃给予艾片后脑组织中的龙脑

2014-04-11罗凤娟

中成药 2014年1期

关键词：龙脑环己烷冰片

田徽，王建，高天，马骁，罗凤娟，黄聪

（1.成都中医药大学药学院，四川成都 611137； 2.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳621000）

GC法测定小鼠灌胃给予艾片后脑组织中的龙脑

田徽1，2，王建1*，高天1，马骁1，罗凤娟1，黄聪1

（1.成都中医药大学药学院，四川成都 611137； 2.绵阳师范学院生命科学与技术学院，四川绵阳621000）

目的建立测定灌胃给予艾片后小鼠脑组织中龙脑的方法，比较灌胃给予艾片与合成冰片后两者在脑组织的透过率。方法样品经环己烷提取，由 GC检测脑组织中龙脑的透过率。 WCOT FUSED SILICA色谱柱（30 m×0.25 mm， 0.25 μm）；柱温为 90 ℃保持 1 min，以 3 ℃ /min 上升至 140 ℃，以 25 ℃ /min 上升至 210 ℃保持 5 min； FID检测器 220 ℃；进样口为 200 ℃；载气为 N2；燃气为 H2；助燃气为空气；体积流量 1.0mL/min；分流比 1 ∶20。结果测定方法的精密度及回收率均符合生物样品中活性成分定量测定的要求。艾片灌胃 5 min 的龙脑透过率即可达0.174%，在 15 min 左右基本达最高峰，为 0.225%，之后逐渐减少。合成冰片灌胃 5 min 的龙脑透过率为 0.113%，于 20 m in 达最高峰，为 0.190%，之后迅速减少。结论艾片组脑组织所含龙脑进入脑组织的速度及透过率均略优于合成冰片组。

艾片；合成冰片；龙脑；GC

艾片为菊科植物艾纳香 Blumea balsamifera （ L.） DC.的新鲜叶经提取加工制成的结晶。《药材资料汇编》记载其：甘，温平，无毒”。《广西中药志》载其： “味辛苦，性温，无毒”。主治方面，《药材资料汇编》载其： “去恶气，辟瘟疫，杀虫疗癣，治中暑霍乱”。《中国药典》 2010年版一部记载其： “辛、苦，微寒。归心、脾、肺经。功效主治：开窍醒神，清热止痛。用于热病神昏、痉厥，中风痰厥，气郁暴厥，中恶昏迷，目赤，口疮，咽喉肿痛，耳道流脓”。其功效与记载合成冰片一致［1］。目前虽有关于冰片在血液及脑组织中成分定量测定的报道［2-10］，也有部分测定含艾片在血液及肠中的量的报道［11-12］，但未见艾片在脑组织中含有量测定的研究报道。本实验采用气相色谱法，建立了小鼠灌胃艾片后脑组织中龙脑的检测方法，测定了小鼠灌胃给予艾片与合成冰片后脑组织中龙脑的量，并比较了给予艾片与合成冰片后脑组织中龙脑的透过率，为进一步比较艾片与合成冰片的脑保护作用及其机制奠定基础。

1 材料

1.1 仪器 Varian450-气相色谱仪（美国 Varian 公司），BP211D电子天平（德国 Sartorius公司）， 5415D离心机（德国 Eppendof）公司， WH-3 旋涡振荡器（上海沪西分析仪器厂）。

1.2 动物 KM种雄性小鼠，成都达硕生物科技有限公司提供，许可证号 SCXK （川） 2008-24。

1.3 药品与试剂艾片（贵州罗甸产艾纳香采用蒸馏提取法制取所得，经测定其含龙脑 87.03%），合成冰片（购于绵阳天诚大药房，经测定其含龙脑 57.34%），均符合 2010年版《中国药典》要求。龙脑对照品（中国药品生物制品检定所， 110881-201107），环己烷（色谱纯，成都科龙试剂有限公司），萘（色谱纯，成都科龙试剂有限公司）。

2 方法与结果

2.1 色谱条件 WCOT FUSED SILICA色谱柱（30 m × 0.25 mm ID COATING： CP-SIL 8 CB DF=0.25 μm）；柱温在 90 ℃ 保持 1 min，以 3 ℃ /min 上升至 140 ℃，以 25℃ /min上升至 210 ℃保持 5 min； FID检测器 220 ℃；进样口为200 ℃；载气为 N2；燃气为 H2；助燃气为空气；体积流量 1.0 mL/min；分流比 1 ∶20。

2.2 溶液配制

2.2.1 内标萘液的配制称取萘 11.9 mg，用环己烷溶解并稀释至 10 mL，再精密吸取 1 mL，用环己烷稀释至 10 mL，得到 0.119 mg/mL的内标萘溶液。

2.2.2 对照品溶液的配制精密称取约 10 mg龙脑对照品，用环己烷定容于 10 mL量瓶中，得质量浓度为 1.015 mg/mL的龙脑的对照品贮备液。分别用环己烷稀释至约0.507 5 mg/mL、 0.101 5 mg/mL、 0.050 75 mg/mL、0.010 15 mg/mL、 0.005 507 5 mg/mL。

2.3 样本采集将 30 只 KM小鼠分为 10 组，每组 3 只，灌胃给予艾片（已测定其含龙脑量为 87.03%） 500 mg/kg，于给药后 0、 5、 10、 15、 20、 25、 30、 60、 90 min后取脑组织，制成匀浆液（1 mL生理盐水溶解 0.1 g组织），取 lmL匀浆液，加入 20 μL内标萘液，用 1mL的环己烷旋涡振荡 3 m in， 15 000 r/min 离心 10 min，即得艾片样液。另取 30 只小鼠 KM小鼠分为 10 组，每组 3 只，同法灌胃给予 500 mg/kg合成冰片（已测定其含龙脑量为57.34%），与相应的时间点采集及处理得合成冰片样液。

2.4 方法学考察

2.4.1 方法专属性在上述色谱条件下，龙脑对照品在9.65min 时出峰，内标萘在 10.25min 时左右出峰，二者分离效果较好，见图1。

图1 对照品及部分样品 GC色谱图

2.4.2 脑组织内龙脑标准曲线的制定取 1 mL空白脑组织匀浆液（1 m L生理盐水溶解 0.1 g组织）中加入 20 μL内标萘液和20 μL相应的龙脑对照品贮备液，用1mL的环己烷旋涡振荡 3 min， 15 000 r/m in 离心 10 min，吸取上清液1μL直接进样，记录色谱图，以最终进样质量浓度为横坐标，各龙脑峰面积与内标峰面积比值为纵坐标，计算回归方程为 y=0.329 8x-0.014 8， r2=0.999 2，可见进样线性范围为0.101 5 ～20.30 μg/mL，该方法最低检测限为0.101 5 μg/mL。

2.4.3 精密度试验取 1 m L空白脑组织匀浆液，分别加入龙脑对照品贮备液（0.5 mg/mL、 0.05 mg/mL、 0.005 mg/mL） 20 μL和内标液 20 μL，制成高、中、低 3 个含有量的样品，每个质量浓度做 5 个平行样，按 “2.4.2” 项方法连续测5 d，记录色谱图。计算日内和日间精密度。高、中、低质量浓度日内精密度分别为 7.49%、 4.26%、5.12%；日间精密度分别为 7.60%、 3.63%、 6.22%。按照生物样品中精密度用质控样品的日内和日间相对标准差（RSD）表示， RSD一般应小于 15%，在 LLOQ附近 RSD应小于 20%.本测定方法的精密度符合要求［13］。

2.4.4 回收率试验

2.4.4.1 相对回收率由 “2.4.3” 项记录的色谱图，计算龙脑测得量，将其与加入龙脑对照品的量相比计算，得到相对回收率。高、中、低质量浓度的相对回收率分别为97.76% ±7.29% （ RSD 为 7.45%）， 99.95% ±4.07%（RSD为 4.07%）， 106.71% ±3.20% （RSD为 3.00%）。按照相对回收率应为 85% ～115% （ LLOQ附近 80 ～120%），该定量测定方法的相对回收率符合要求［13］。

2.4.4.2 提取回收率于 1 mL环己烷中，分别加入 0.5 mg/mL、 0.05mg/mL、 0.005 mg/mL的龙脑对照品贮备液20 μL，加入 20 μL内标萘液，吸取上清液 1 μL直接进样，记录色谱图，计算样品中龙脑的量。将由 “2.4.3” 项记录的生物样品龙脑峰面积/内标峰面积与不加空白血浆配制的相应质量浓度的溶液直接进样测定得到的龙脑峰面积/内标峰面积进行比较，得到提取回收率。高、中、低质量浓度的提取回收率分别为 86.11% ±6.45% （ RSD 为7.49%）， 85.91% ±3.66% （RSD为 4.26%）， 83.94% ± 4.30% （RSD为 5.12%）。该定量测定方法的提取回收率符合要求［13］。

2.5 样本测定吸取样品上清液 1 μL直接进样，记录色谱图，测定脑组织中的含有量（μg/g），并计算每个样本的透过率。透过率（%） =脑组织中龙脑量/给予的龙脑量。结果如表 1、表 2，图 2。

表 1 艾片与合成冰片样液给药后脑组织中龙脑量的比较（n=3）

表2 艾片与合成冰片样液给药后脑组织中龙脑透过率的比较（n=3）

图2 艾片与合成冰片样液给药后脑组织中龙脑透过率的比较

由表1，表2及图2可以看出，艾片灌胃后，龙脑迅速进入脑组织， 5 m in 后即可达 0.174%，在 15 min 左右基本可达最高峰，最高值为 0.225%，之后逐渐减少， 60min 基本只有最高值的一半左右，在 90 min 仅存 0.070%。

而合成冰片灌胃后，龙脑进入脑组织比例略低于艾片，5 min 仅为 0.113%，而其最高峰出现也晚于艾片，于 20 min 达最高峰，最高值也明显低于艾片，仅为 0.190%，之后迅速减少，且消除速度也较艾片快，在 90 min 仅存 0.026%。

3 讨论

冰片是开窍醒神常用中药，《中国药典》 2010 年版一部收载与冰片相关药物有 3种［天然冰片、艾片与冰片（合成龙脑）］，但是药典中并未将这3 种冰片的功效主治加以区分。目前，国内仅张伯礼课题组比较了合成冰片与天然冰片的毒性研究［14-15］，而关于艾片的药理及毒性研究，特别是艾片与合成冰片的功效及作用机理比较研究国内外尚未有报道。本实验基于艾片 “开窍醒神” 的主要功效，选择其在靶器官脑组织的分布进行研究。

关于成分定量测定的方法方面，本实验建立了测定小鼠灌胃艾片后脑组织中龙脑的方法，该方法的精密度及回收率均符合生物样品中物质定量测定的要求，因此该方法可行，合理。给予相同剂量的艾片和合成冰片后，艾片组小鼠脑组织中所含龙脑大于合成冰片组。

关于选择透过率来比较的依据方面，由于艾片中龙脑含有量约为 85%，而合成冰片中龙脑含有量约为 57%，两组小鼠灌胃给予相同剂量，但实际各药液所含龙脑自身存在的相差性不可避免。如果仅采用脑组织中龙脑量的绝对值来比较艾片与合成冰片给药后脑组织分布多少，可能不能全面反映出二者的吸收差异。本实验重点基于二者所含龙脑的相对量，即进入脑组织的龙脑量所占给予龙脑实际量的百分比进行比较，故该数据可以相对更全面客观反映出艾片与合成冰片在生物体脑组织中分布的差异。

血脑屏障对于维持中枢神经系统内环境的稳定具有重要的意义，透过血脑屏障率反映了治疗药物进入脑内的量，是药物治疗脑部疾病的基础。本实验结果可以看出，艾片所含龙脑能迅速进入并分布于脑组织中，透过率均略优于合成冰片，结合艾片组小鼠脑组织中所含龙脑绝对值肯定大于合成冰片组，可推测艾片与合成冰片治疗脑部疾病的作用可能会存在一定差异。但是这种药效差异以及二者透过血脑屏障的作用机制，尤其对血脑屏障开放密切相关的P-糖蛋白通路的影响，还有待于进一步的研究。

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