葛根总黄酮对利血平致偏头痛大鼠的保护作用

唐黎明， 石劲敏， 张素慧， 宁 炼， 金若敏， 张 彤*

（1.上海市食品药品检验所药理毒理室， 上海 201203； 2.上海中医药大学， 上海 201203）

葛根总黄酮对利血平致偏头痛大鼠的保护作用

唐黎明1， 石劲敏1， 张素慧1， 宁 炼1， 金若敏2， 张 彤2*

（1.上海市食品药品检验所药理毒理室， 上海 201203； 2.上海中医药大学， 上海 201203）

目的 研究葛根总黄酮经鼻给药对利血平致偏头痛模型动物的主要治疗作用及其机制。方法 采用皮下注射利血平制备大鼠偏头痛模型，实验设阴性对照组、模型组、麦角胺咖啡因组和葛根总黄酮组。除麦角胺咖啡因组给药1次外， 其余各组共给药 3 次， 每次间隔 20min。 各组首次给药后 60min 取血与脑组织， 观察给药后大鼠脑内去甲肾上腺素、 多巴胺、 高香草酸、 5-羟色胺 （5-HT）、 5-羟吲哚乙酸等神经递质水平的变化及大鼠血液中一氧化氮合酶（NOS） 水平的变化。 结果 模型组动物脑内多巴胺、 5-HT水平显著降低， 血液中的 NOS 水平明显升高； 滴鼻给予不同剂量的葛根总黄酮能明显提高利血平致偏头痛模型动物脑内去甲肾上腺素、 多巴胺的水平， 大鼠血液中的 NOS水平显著降低。结论 葛根总黄酮滴鼻给药能明显改善利血平致偏头痛的症状。

葛根总黄酮；利血平；偏头痛；大鼠

葛根为豆科植物野葛 Pueraria lobata （ Willd.）Ohwi的干燥根。 现代研究表明， 葛根可用于解热和治疗偏 头 痛［1］。 经 鼻 给 药， 中 医 称 为 鼻 疗 法。中医学认为 “鼻为肺之窍，其气上通于脑，下行于肺”。现代研究表明，药物经鼻吸收能发挥局部和全身治疗作用，并具有一定的脑靶向性。鼻黏膜有丰富的血管淋巴网，故经鼻给药吸收迅速，可避免肝脏的首过效应，生物利用度高，尤其适用于胃肠道吸收较差的药物。本实验拟对新的给药途径——葛根总黄酮滴鼻对葛根抗利血平致大鼠偏头痛作用进行研究，在前期实验中已对硝酸甘油致偏头痛模型进行了研究，发现葛根总黄酮滴鼻给药能明显改善硝酸甘油致偏头痛的症状。根据偏头痛的发病机理，选取利血平致偏头痛病理模型，观察总黄酮化合物滴鼻给药是否对这种病理模型有效，从而为开发新的治疗偏头痛药物及葛根新的给药途径提供更多的实验依据。

1 材料与动物

1.1 试剂与仪器 葛根总黄酮， 自制， 总黄酮纯度大于 78.3%，葛根素大于 30%，批号为 070511。麦角胺咖啡因片 （ Ergotamine Caffeine）， 上海医药（集团） 有限公司信谊制药总厂生产， 批号为060401。 利血平 （ 原料）， 海南制药厂生产， 批号： 070201。 去甲肾上腺素对照品、 盐酸多巴胺对照品、 2，3-二羟基苯甲酸 （DHBA） 对照品和 5-羟色胺 （5-HT） 均为 Fluka产品。 高香草酸 （ HVA）和 5-羟吲哚乙酸 （5-HIAA） 均为 Sigma产品； 甲醇为色谱纯， 德国 Merck 产品。 辛烷磺酸钠为日本东京化成产品。 EDTA-Na2、 磷酸氢二钠、 柠檬酸、氯化钠、 高氯酸均为分析纯试剂。 水为 Millipore超纯水。葛根总黄酮溶液：称取供试品，加适量纯化水后超声溶解并稀释至质量浓度为 78、 156、 235 mg/mL的溶液， 用于滴鼻给药。 麦角胺咖啡因溶液： 临用时以纯化水配成 0.2 mg/mL。

液相色谱仪 （ Waters2695 型-2465 型电化学检测器， 配 有 Empower数 据 处 理 系 统）。 Shimatzu UV2100 紫外分光光度计、 FLUKO F6/10 高剪切分散乳化机、 Sigma公司 3K30 型高速 离心机、 Hettich ROTANTA 460R高速冷冻离心机等。

1.2 动物 SD大鼠， 雌雄皆用， 体质量 230 g～250 g， 由上海斯莱克实验动物有限责任公司提供，生产许可证号 SCXK （沪） 2007-0005。 动物饲养房间的环境及光照周期条件为温度 19 ～23 ℃，相对湿度 40% ～70%， 光照周期 12 h 明/12 h 暗， 氨浓度范围≤14 mg/m3。

2 方法

2.1 模型及分组 取大鼠， 随机分为 6 组， 分别为阴性对照组、模型组、麦角胺咖啡因组、葛根总黄酮滴鼻给药低、中、高剂量组。除阴性对照组外， 其余各组大鼠利血平皮下注射 40 mg/kg造模。各组均在造模后第4日给药。麦角胺咖啡因组一次口服灌胃麦角胺咖啡因 2 mg/kg。阴性对照组、模型组和葛根总黄酮组均给药 3次，每次间隔20 min。 阴性对照组和模型组均滴鼻给予 40 μL/只的纯化水；葛根总黄酮组分别滴鼻给予 78、 156、235 mg/mL的葛根总黄酮， 给药体积 40 μL/只，给药总剂量为 3 次给药总量， 分别为 37、 75 和113 mg/kg。 一部分大鼠麻醉取血， 另一部分大鼠取脑组织。阴性对照组、模型组和葛根总黄酮组动物于首次给药后 60 min， 麦角胺咖啡因组于给药后60 min 腹腔注射 1 mg/kg乌来糖麻醉， 腹主动脉取血，置离心管中，置4℃冰箱中保存。1 h后，4 000 r/min， 4 ℃离心 15 min，取上清， 用于一氧化氮合酶 （NOS）测定。 给药后 60 min 将大鼠处死置于冰台上，快速取出大鼠脑组织，滤纸吸干组织表面的水分和血液，称定质量，记录，铝箔纸包裹于液氮保存。用于神经递质的测定。

2.2 指标检测

2.2.1 神经递质测定 样品处理： 测定时取脑组织加 10 倍质量蛋白沉淀液 （0.1 mol/L高氯酸溶液含EDTA-Na20.01 mmol/L）， 匀浆。取 1 mL脑组织匀浆，加 100 μL内标溶液 （DHBA溶液 1 μg/mL），30 000 r/min 离心 30 min， 分取上清液 50 μL， 进样分析。 测试条件： Agilent Zorbax Bonus-RP C18色谱柱 （150 mm ×4.6 mm，5 μm）； 流 动 相 为 80 mmol/L磷酸氢二钠缓冲液 （内含辛烷磺酸钠 0.05 mmol/L， EDTA-Na20.22 mmol/L， 柠 檬 酸 58 mmol/L和氯化钠 5 mmol/L， pH调节至 4.3） -甲醇 （95 ∶5， v/v）； 体积流量为 1.0mL/min； 进样量为 50 μL；柱温 30 ℃； 工作电压 +1.00 mV。 检测参数： 测定去甲肾上腺素、 多巴胺、 高香草酸、5-羟色胺 （5-HT）、 5-羟吲哚乙酸 （5-HIAA） 水平。由于脑组织本身含有以上各种神经递质，无法取得空白脑组织作为基质进行方法学研究，且实验结果采用组间比较，因此可不必测得递质水平的绝对值，而直接用峰面积之比 A递质/A内标进行比较。

2.2.2 NOS 测定 取血清， 硝酸还原酶法测定血液中 NOS水平。步骤按试剂盒说明书操作， 测得各样本吸光度值， 计算 NOS水平。

2.3 数据处理 数据采用 SPSS 10.0 统计软件进行分析。

3 结果

3.1 脑组织匀浆中神经递质和内标 DHBA的典型色谱图见图1。

图1 测定脑组织匀浆中神经递质和内标 DHBA的典型色谱图Fig.1 TyPical chromatogram of neurotransim itter and internal standard in blood tissue homogenate

3.2 对利血平致偏头痛模型大鼠脑内神经递质的影响 与阴性对照组相比，模型组动物的多巴胺、5-HT水平显著降低 （P＜0.01）； 麦角胺咖啡因组可明显提高模型动物脑内多巴胺 （P＜0.05）； 不同剂量的葛根总黄酮组均能明显提高模型动物脑内去甲肾上 腺 素、 多 巴 胺 和 5-HIAA的 水 平 （P＜0.05 或 P＜0.01）。 见表 1。

3.3 对利血平致偏头痛模型大鼠血液内 NOS 的影响 与阴性对照组相比，模型组动物血液内的NOS水平明显升高， 给予阳性对照或药物后， NOS水平显著降低，与模型组相比差异具有统计学意义（P＜0.01）。 见表 2。

4 讨论

葛根为豆科植物野葛 Pueraria lobata （Willd.）Ohwi的干燥根， 有解肌， 退热， 生津， 透疹， 升阳，止泻等功能。古代多用于外感发热头痛、项强、口渴、消渴、麻疹不透、热痢、泄泻等症。现代研究表明，葛根中的黄酮类化合物为其主要化学成分，临床应用广泛，尤以葛根素为著，葛根对正常和高血压动物均有一定的降压作用，静脉注射葛根浸膏、总黄酮、葛根素及其脂溶性部分和水溶性部分均能使正常麻醉犬的血压短暂而明显的降低，口服葛根水煎液或醇浸膏对高血压犬也有一定的降压作用。 在临床上， 对50例高血压病患者静注葛根素再次证实其有降压作用。经鼻给药系统的研究是目前药学研究的一个热点，药物经鼻给药起效快， 副作用小， 故本实验对新的葛根制剂——葛根总黄酮滴鼻剂抗利血平致大鼠偏头痛的作用及机制进行了研究。

表1 葛根总黄酮对利血平致偏头痛模型大鼠脑内神经递质的影响 （）Tab.1 Effect of total flavone from pueraria on neurotransm itters in brain of m igraine rats induced by reserPine（）

表1 葛根总黄酮对利血平致偏头痛模型大鼠脑内神经递质的影响 （）Tab.1 Effect of total flavone from pueraria on neurotransm itters in brain of m igraine rats induced by reserPine（）

注：与模型组比较，*P＜0.05；**P＜0.01

组 别 剂 量 /（mg·kg-1） 动物 数 /只 去 甲肾 上腺素 多巴 胺 高 香草 酸 5-HT 5-HIAA阴性对照组 / 8 2.03 ±0.45 0.76 ±0.07** 0.015 ±0.003 0.59 ±0.07** 0.20 ±0.02模型组 / 10 1.84 ±0.66 0.52 ±0.09 0.016 ±0.004 0.21 ±0.06 0.22 ±0.04麦角胺咖啡因组 2 8 2.59 ±0.93 0.65 ±0.13* 0.021 ±0.006 0.29 ±0.07 0.27 ±0.04葛根总黄酮组 37 8 3.11 ±0.77* 0.66 ±0.07* 0.027 ±0.014 0.26 ±0.05 0.30 ±0.04**75 8 3.16 ±0.82** 0.68 ±0.05** 0.023 ±0.010 0.26 ±0.05 0.25 ±0.02 113 7 2.74 ±0.73 0.77 ±0.08** 0.018 ±0.009 0.26 ±0.05 0.29 ±0.05*

表2 葛根总黄酮对利血平致偏头痛模型大鼠血液内 NOS的影响 （）Tab.2 Effect of total flavone from pueraria on NOS in blood ofm igraine rats induced by reserPine（）

表2 葛根总黄酮对利血平致偏头痛模型大鼠血液内 NOS的影响 （）Tab.2 Effect of total flavone from pueraria on NOS in blood ofm igraine rats induced by reserPine（）

注：与模型组比较，*P＜0.05，**P＜0.01

NOS /（U·mL-1）阴性 对照 组 / 12 23.888 0 ±1.945 6**模型 组 / 12 27.662 1 ±2.398 9麦角 胺咖 啡因组 2 12 21.467 1 ±3.278 4**葛根 总黄 酮组 37 12 22.336 6 ±0.829 2**75 12 24.976 9 ±1.884 5*113 12 23.379 5 ±0.993 6组 别 剂量/（ mg·kg-1）动物数/只**

利用利血平注射液注射小鼠可产生偏头痛模型［2］。 利血平可用于高血压危象和精神病性躁狂症状。它是一种肾上腺素能神经元阻断性抗高血压药。一方面使周围交感神经末段去甲肾上腺素贮存耗竭，使交感神经冲动的传导受阻，从而扩张血管、降低周围血管阻力发挥降压作用。另一方面，也使脑、 心和其他器官中的儿茶酚胺和 5-羟色胺贮存耗竭，而使心率减慢，心排血量减少产生降压作用。因此，利血平化偏头痛小鼠模型是一种常用的模型，具有简便、经济、易得的特点。

本研究中所用制剂为滴鼻剂，由于小鼠鼻腔太小，给药量无法加大，因此，首次尝试采用利血平化偏头痛大鼠模型， 观察对儿茶酚胺和 5-羟色胺类神经递质的影响。造模后观察到大鼠出现明显活动减少，动物摄食减少，体质量增长缓慢，皮温下降等一系列体征变化。同时实验结果显示模型组动物脑组织内的多巴胺、5-羟色胺水平显著降低，与阴性对照组相比有非常显著的差异；去甲肾上腺素水平虽无显著性差异，但也呈下降趋势，表明模型是成功的。这与文献报道利血平化偏头痛小鼠模型的体征变化和神经递质变化是一致的［3-10］。 麦角胺咖啡因可明显提高模型动物脑内多巴胺水平，对5-羟色胺、 去甲肾上腺素和高香草酸都有升高的趋势。不同剂量的葛根总黄酮能明显提高模型动物脑内多巴胺、去甲肾上腺素和高香草酸的水平，与模型组相比均有显著性差异。 对 5-羟色胺也有升高的作用趋势。

一氧化氮 （NO） 是一种血管内皮舒张因子（EDRF）， 在偏头痛和其他头痛产生机制中是一个十分关键的因子。偏头痛与其扩血管作用有关［11-15］。 NO不但激发偏头痛， 而且对保持 偏头痛持续状态非常重要。研究证实偏头痛患者发作期颈静脉血浆中及脑脊液中 NO水平明显升高。由于NO在偏头痛和其他头痛产生中是一个十分关键的因子， 而内源性 NO的合成是在 NOS的参与下合成的， 因此研究 NOS的水平显得尤为重要。 在本实验室的研究中，表明葛根总黄酮滴鼻给药后可以明显降低硝酸甘油致偏头痛大鼠体内血清及脑组织中一氧化氮合酶的水平。本次研究结果表明，利血平化偏头痛大鼠模型组一氧化氮合酶的水平明显上升，与阴性对照比较有非常显著的差异，麦角胺咖啡因可以明显降低一氧化氮合酶的水平，葛根总黄酮各剂量组滴鼻给药后也可以明显降低一氧化氮合酶的水平，与模型组相比均有显著性差异，表明葛根总黄酮在治疗利血平化偏头痛大鼠中降低血液中一氧化氮合酶的水平，减少一氧化氮的合成，是缓解偏头痛症状的机制之一。

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Protective effect of total flavone from pueraria by nasal drug delivery on reser-Pine-inducingm igraine rats

TANG Li-ming1， SHI Jing-min1， ZHANG Su-hui1， NING Lian1， JIN Ruo-min2， ZHANG Tong2*
（1.Shanghai Institute for Food and Drug Control， shanhai 201203， China； 2.Shanghai University of TCM， Shanghai201203， China）

AIM To observe the protective effectand mechanism of total flavone from Pueraria by nasal drug delivery on reserpine-inducingmigraine rats.METHODS The subcutaneous injection of reserpinewas performed on rat tomake themodel formigraine.Ratswere divided into negative control group， model group， ergotamine caffeine group and three total flavone from Pueraria groups.Rats of ergotamine caffeine group were treated by a single oral gavage.Rats of other groupswere treated three times atan interval of twentyminutes.Rats of negative control ormodel group were treated with water of equal volume.Blood and brains of ratswere collected in sixtyminutes after first administration.The effect of total flavone from Pueraria was observed on noradrenalin， dopamine， 5-hydroxytryptamine（5-HT） ， homovanillic acid， 5-hydroxyindole acetic acid in brain and nitric oxide synthase in blood.RESULTS The levels of dopamine， 5-HT in brain ofmigraine rats induced by reserpine significantly decreased， but the level of nitric oxide synthase（ NOS） in blood significantly increased.The levels of noradrenalin，dopamine in brain ofmigraine rats induced by reserpine significantly increased after treatmentwith different dosage total flavone from Pueraria compared withmodelgroup.The level of NOS in blood reduced significantly in total flavone from Pueraria group and ergotamine caffeine group.CONCLUSION Total flavone from Pueraria could reduce the symptoms ofmigraine induced by reserpine in rats.

total flavone from Pueraria； reserpine， migraine； rat

R285.5

： A

： 1001-1528（2014）01-0018-05

10.3969/j.issn.1001-1528.2014.01.005

2013-02-12

上海市人才发展基金 （20111015）； 上海市创新团队及重点学科项目 （J50302）

唐黎明 （1964—） ， 男， 硕士， 主 任药 师， 研究方 向： 药理 毒理。 Tel： （ 021 ） 38839900-26111， E-mail： tangliming@smda. gov.cn

*通信作者： 张 彤 （1972—） ， 男， 博士， 教授。 Tel：（021）51322318， E-mail： zhangtdmj@yahoo.com.cn