健康人外周血烟曲霉硫氧还蛋白还原酶抗原特异性T淋巴细胞检测与结果评价

史利宁，胡毓安，廖红，韩雪，韩丹丹，李晓军，李芳秋

0 引言

在恶性血液病、造血干细胞移植及器官移植患者中，由于存在免疫功能缺陷，侵袭性曲霉病(invasive aspergillosis，IA)是感染死亡的主要原因之一［1］。长期使用皮质类固醇药物和粒细胞缺乏症是IA最主要的危险因素［2］。现有的抗真菌药物对IA的疗效有限，且有较强的毒副作用;因此亟需开辟新的治疗途径，而以曲霉疫苗为基础的预防接种法开始受到越来越多的重视［3］。

早期研究表明曲霉疫苗可在免疫抑制宿主中诱导出保护性免疫应答，从而降低宿主的死亡率。虽然曲霉疫苗保护作用的机制尚不清楚，但已证明T细胞免疫尤其是CD4+Th1型细胞免疫在控制曲霉感染中发挥了极其重要的作用［4］。因此，目前曲霉疫苗的研究主要是寻找可增强或激活Th1细胞免疫的曲霉保护性抗原。但到目前为止，已筛选鉴定的曲霉保护性抗原极少，且无成熟有效的曲霉疫苗可用于临床。

本课题组在前期研究中筛选鉴定了一个新的强免疫反应性烟曲霉硫氧还蛋白还原酶GliT抗原(thioredoxin reductase GliT，TR)［5］。为评估烟曲霉TR蛋白是否具有保护性抗原的潜能，建立并优化了检测TR/抗原特异性T淋巴细胞(TR/AST)分泌干扰素γ(interferon γ，IFN-γ)和白细胞介素-4(interleukin-4，IL-4)的ELISPOT方法，分析健康人在TR的刺激下产生免疫应答的类型，探讨TR抗原特异性T淋巴细胞在IA中的作用。

1 资料与方法

1.1 研究对象选取我院门诊20名健康体检者，男性12名，女性8名，年龄25～35岁。本研究通过医院伦理委员会批准(伦理批件号:2013GJJ-063)，研究对象均签署知情同意书。

1.2 主要试剂和仪器TR抗原由中心实验科分子生物实验室利用基因工程技术自制提取［6］，IFN-γ及IL-4 ELISPOT检测试剂盒、EZ-Culture无血清培养基，Biosys Bioreader 4000 PRO斑点分析仪及分析软件均为深圳市达科为生物技术有限公司产品。

1.3 主要方法

1.3.1 外周血单个核细胞(peripheral blood mononuclear cell，PBMC)分离采空腹静脉血5～10 mL，无菌肝素抗凝，加等量等渗盐水稀释后加在淋巴细胞分离液上，800×g离心30 min，分离PBMC，用EZCulture液洗涤800×g 10 min离心2次，以EZ-Culture无血清培养液重悬并行细胞计数。

1.3.2 确定ELISPOT试验条件随机选择2名健康人进行试验，用方阵滴定法优化ELISPOT反应条件。设定TR抗原终浓度为45，30，20，10，5μg/孔五个浓度，PBMC用量为1×106，3×105，1×105，3×104个/孔四个浓度。根据系列抗原浓度及PBMC用量获得的IFN-γ阳性斑点形成细胞(spot forming cell，SFC)频数结果，确定TR抗原的工作浓度及PBMC的用量。

1.3.3 特异性分泌IFN-γ SFC及IL-4 SFC的ELISPOT检测无菌条件下使用ELISPOT板及相关试剂，具体实验步骤如下:每孔加入200μL EZ-Culture无血清培养基，室温静置5～10 min后倾去。每孔加入100 μL 3×105PBMC，以10 μL TR抗原(10 μg/孔)作为特异性抗原刺激物，每份检测标本设3个重复孔。同时设2个阳性对照孔、2个阴性对照孔、2个试剂对照孔，阴、阳性对照孔细胞浓度为每孔1×105细胞，试剂对照孔加EZ-Culture无血清培养基，阳性对照孔的刺激物为PHA/PMA，阴性对照孔的刺激物为无血清培养基。放入37℃，5%CO2培养箱培养20h。快速倾倒孔内细胞后，每孔加200μL 4℃预冷的去离子水，冰浴10 min低渗裂解细胞。倾去液体，每孔加250 μL磷酸盐吐温缓冲液(PBST)洗涤7次后在干净纱布上拍干。每孔加100 μL相应的生物素标记抗体，于37℃孵育1h。PBST洗涤5次后，揭开板底的塑料保护层，用PBST冲洗。每孔加100 μL工作浓度酶标链霉亲和素，37℃孵育1 h。PBST洗涤5次，最后每孔加100 μL现配的AEC显色液，于室温条件下避光静置25 min显色。用自来水洗涤3次以终止显色反应。将板放置在室温阴凉处晾干。用Biosys Bioreader 4000 PRO斑点分析仪计数特异性分泌细胞因子的阳性SFC频数。

1.4 统计学分析应用SPSS 18.0软件进行统计学分析，各组检出的特异性分泌IFN-γ SFC和IL-4 SFC为非正态分布，组间比较采用Mann-Whitney U检验;TR与其他曲霉保护性抗原特异性T淋巴细胞的比较用χ2检验。以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 ELISPOT试验条件的确定健康人PBMC对不同量TR抗原刺激所产生的IFN-γ SFC频数无明显差异;在相同量TR抗原刺激下，产生的IFN-γ SFC频数随PBMC用量的减少而减少。根据方阵滴定法确定TR抗原的终浓度为10 μg/孔，PBMC用量为3×105/孔。在此条件下特异性分泌IFN-γ SFC频数最优，2名健康人的阳性SFC频数分别为53个和143个。见图1。

图1 不同抗原浓度及PBMC用量获得的IFN-γ SFC频数结果Figure 1 Frequencies of IFN-γ spot－forming cells induced with different TR antigen concentrations and peripheral blood mononuclear cells(PBMC)

2.2 ELISPOT检测T淋巴细胞特异性分泌IFN-γ SFC与IL-4 SFC的结果TR刺激后，健康人特异性分泌IFN-γ和IL-4的SFC频数分别为15(3.5，59.5)个和0(0，0)个。IFN-γ的SFC频数显著高于IL-4(P＜0.001)，其中刺激后产生强IFN-γ应答(SFC≥20个)的健康人占45%(9/20)，而19名健康人在TR刺激后不产生IL-4应答，仅1名产生IL-4应答。见图2。

图2 20名健康人特异性分泌IFN-γ和IL-4的SFC频数比较Figure 2 Frequencies of IFN-γ and IL-4 spot－formingcells(SFC)in the 20 healthy individuals

2.3 与文献报道的曲霉保护性抗原的比较与文献报道的曲霉保护性抗原Asp f3和Asp f9/16相比［4，7－8］，TR抗原刺激健康人PBMC所产生的强IFN-γ应答无显著差异，但IL-4应答明显低于Asp f3(P＜0.001)。见表1。

表1 TR与其他曲霉保护性抗原在诱导IFN-γ和IL-4免疫应答中的比较(n)Table 1 Comparison of TR and other Aspergillus protective antigens in inducing IFN-γ and IL-4 immune responses(n)

3 讨论

IA的有效治疗仍是目前临床亟待解决的重要问题，而预防接种正成为IA治疗的新手段，寻找高效的曲霉保护性抗原则是预防接种能否成功的关键。动物试验表明在小鼠IA动物模型中Th1/Th2比例的失调及向Th2型免疫反应的转变导致了IA的恶化及不良结局［9］。临床试验观察在健康人群和发生IA后存活的患者中均发现了显著的产生IFN-γ抗原特异性淋巴细胞增殖［9］，证实了Th1型免疫反应在控制曲霉感染中发挥了极其关键的作用［10］。

当T细胞受到某种抗原刺激时，针对该抗原的特异性T淋巴细胞就会活化，产生特定的细胞因子。ELISPOT技术可通过检测其分泌特定细胞因子的SFC频数来直观地反映T细胞的免疫反应类型。本研究以烟曲霉TR为刺激物，观察其刺激正常人外周血淋巴细胞后的免疫应答。结果显示:TR刺激后可产生特异性T淋巴细胞的活化，主要表现为IFN-γ SFC频数的明显增加，而IL-4 SFC频数几乎为零，且45%的健康人表现为强IFN-γ应答。由此可见，健康人体内普遍存在TR特异性T细胞族群，可经TR刺激后呈Th1优势状态，该免疫反应可以提高机体对未来曲霉感染的防御能力，表明TR具有作为保护性抗原的潜能。由于不同的人对TR刺激后产生的免疫反应强度不一且差异较大，因此还需寻找其他方法，比如使用佐剂等来增强机体对TR抗原刺激的免疫效应，诱导机体产生有效的免疫保护反应。

文献报道的烟曲霉保护性抗原有Asp f3和Asp f9/16等，其中最早检测的是曲霉变应原Asp f9/16［7，11－13］。Bozza等［9］发现，在中性粒细胞缺乏症小鼠模型中，鼻内接种重组Asp f9/16和佐剂CpG ODN可诱导抗烟曲霉感染的保护性应答。有研究证明重组Asp f3和截短Asp f3(去除了IgE结合位点)均可提高皮质类固醇免疫抑制小鼠在烟曲霉孢子肺感染中的存活率(40%)［11－13］。而Chaudhary等［4］用ELISPOT方法进一步证实，Asp f3和Asp f9/16可诱导健康人PBMC产生较强的Th1型免疫应答。与Asp f3和Asp f9/16相比，烟曲霉TR抗原也可刺激机体产生较强的Th1性应答，与前者无显著差异;且TR几乎不刺激机体产生Th2型应答，优于Asp f3和Asp f9/16。这可能是因为Asp f3和Asp f9/16本身是烟曲霉变应原，能刺激机体产生过敏反应，而TR不属于烟曲霉的变应原，过敏性肺曲霉病患者的血清中几乎检测不到抗TR的IgE型抗体［14］。

综上所述，烟曲霉TR抗原可刺激机体淋巴细胞产生较强的Th1型应答且几乎不产生Th2型应答，表明TR抗原具有作为保护性抗原的潜能;但仍需要进一步的研究来加以验证。

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