精神分裂症患者血清差异microRNA谱的检测

彭瑛，黄远帅，邓正华，程松，温先勇，王开正

0 引言

精神分裂症(schizophrenia，SZ)是一种常见的且经常导致精神致残的慢性大脑疾病，具有多种临床症状［1］。据有关资料统计，全世界SZ患者约5000万，且发病率仍在逐年递增［2］。SZ的诊断和疗效观察对于临床和司法鉴定仍然是一件棘手的问题，目前主要根据复杂的临床症状，如意识障碍、智能障碍、情感、行为等主观指标来判断，而这些症侯群多和其他精神疾病交叉出现并发生重叠。因此，早期、快速、客观地实现SZ的正确诊断，是精神病学研究领域中的一大难题。近年来研究发现，转录后

基因调节和相关的非编码小分子RNA(microRNA，miRNA)可能是一个新的重要的与神经网络结构有关的调节因子。研究表明miRNA在SZ的不同脑皮质区和外周血单个核细胞中存在异常表达［3］，并可作为SZ诊断的生物学标志物。本研究拟用miRNA芯片技术和RT-PCR方法对SZ血清miRNA表达谱及其临床意义进行研究。

1 资料与方法

1.1 研究对象精神分裂症患者组(SZ组)来自2011年8月至2012年4月在泸州医学院附属医院精神科住院且临床资料齐全的SZ患者。纳入标准:①患者诊断标准符合国际精神疾病分类与诊断标准第10版(ICD-10);②首次发病;③未接受抗精神病药物治疗;④无自知力。排除标准:脑器质性和躯体疾病所致的精神障碍患者。共收集10例患者，男性4例、女性6例，年龄14～48岁，平均年龄(31.1±11.7)岁。样本的收集都经本院精神科医师协助取得患者本人或家属同意。对照组10名健康人来自泸州医学院学生和门诊健康体检中心，自愿参与试验。男性5例、女性5例，年龄21～45岁，平均年龄(25.1±6.3)岁。

1.2 试验试剂

1.2.1 筛选试剂和仪器总RNA的提取和miRNA的提取分别使用Invitrogen公司的TRIzol试剂盒和Ambion公司的MirVana®microRNA提取试剂盒进行;荧光标记用Affymetrix®GeneChip®公司提供的FlashTagTMBiotin RNA标记试剂盒(Genisphere，FT30AFYB);Invitrogen公司提供的染色和洗涤试剂盒;Affymetrix公司的GeneChip miRNA 2.0芯片(miRBase v 15.0)。仪器包括Affymetrix®Hybridization Oven 640，Affymetrix®Fluidics Station 450，Affymetrix®GeneChip®Scanner 3000。

1.2.2 RT-PCR验证试验的主要试剂和仪器总RNA提取试剂盒和逆转录及定量PCR试剂盒均由北京旷博生物技术有限公司提供，使用ABI7500FAST扩增仪进行RT-PCR进行定量扩增。

1.3 研究方法

1.3.1 血标本的处理全部研究对象取清晨空腹静脉血4 mL，静置10 min后，4℃温度下以1600×g离心力离心5 min分离血清，将血清放置在EP管中-80℃保存待用。

1.3.2 miRNA芯片检测总RNA的提取和miRNA的标记纯化、芯片的杂交、图像采集均按试剂说明书进行，其检测流程见图1。

图1 miRNA芯片检测原理流程图Figure 1 miRNA microarray principle flowchart

1.3.3 实时荧光定量PCR验证对芯片筛选结果进行验证，以确保芯片结果的可靠性。包括以下3个步骤:①miRNA的3′尾部添加Poly A，反应体系20 μL包括10X buffer.E.coli poly(A)Polymerase 2.0 μL、10 mM ATP 2.0 μL、Nase Inhibitor 0.5 μL、Total RNA 1 μL、E.coli poly(A)Polymerase 0.5 μL和1 μL External Control 2，RNase-free water定容至最终体积20 μL，在PCR仪37℃孵育1 h。②cDNA链的合成。取出第1步的反应管向每个反应管中加入0.5 μL反转录引物(RT Primer)，在PCR仪70℃孵育5min，然后冰上保存至少5min待用。cDNA链的合成反应体系为40 μL，括5×M-MLV Reverse Transcriptase Buffer 8.0 μL、10 mM dNTP 2.0 μL、RNase Inhibitor 1.0 μL、加Poly A尾反应产物20.0 μL、RNase-free water 8.0 μL、M-MLV Reverse Transcriptase 1.0μL，在PCR仪中50℃孵育50min，反应后70℃保温15 min。③荧光定量PCR(qPCR)反应。反应体系20 μL包括第2步反应获取的cDNA样本1.0 ng，10X UPM(10 μmol/L)2.0 μL、10X Gene specific primer(10 μmol/L)2.0 μL、2X qPCR Mix 10.0 μL、RNase-free water定容至最终体积20 μL。反应条件:95℃预变性5 min，95℃15 s，60℃45 s，40个循环。熔解温度循环参数:95℃15 s，60℃1 min，95℃15 s。

1.4 统计学分析使用SAM(Significance Analysis of Microarrays)软件统计分析2组间差异表达的miRNA。应用SPSS 17.0统计学软件Kruskal Wallis H检验对2组之间PCR定量结果进行比较分析，渐进性以P≤0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 差异miRNA的筛选使用SAM软件进行差异miRNA筛选，筛选标准包括|Score(d)|≥1.5，信度值q-value控制在5%以内，变化倍数≥1.5或Fold Change≤0.667，样本数≥3。据此标准筛选出3个差异表达的miRNA，其芯片信号结果见表1。

表1 芯片筛选出的3个差异表达miRNA探针信号结果Table 1 Three kinds of differentially expressed miRNA probe signal results

表1结果显示，SZ组与对照组比较hsa-miR-1281呈高表达，变化倍数1.509;hsa-miR-2861、hsamiR-638成低表达，变化倍数分别为0.642、0.516。

2.2 实时定量PCR验证结果验证试验溶解曲线和扩增曲线结果显示反应过程顺利，特异性较好，无非特异性扩增，表明定量PCR结果可靠。以一定量的人工合成的类似miRNA的小分子片段作为外参，用2-Δct计算miRNA的相对表达量。其结果证实，hsa-miR-2861和hsa-miR-638在SZ患者中均成低表达，分别与健康受试者比较，其差异有统计学意义(P＜0.05);hsa-miR-1281在SZ组呈明显的高表达，与健康受试者比较，差异有统计学意义(P＜0.05)，与芯片初筛结果一致，见表2。

表23 个miRNA的PCR验证结果相对浓度比较(x±s)Table 2 The relative concentration of three miRNAs PCR validation results(x±s)

3 讨论

近年来研究发现，转录后基因调节和相关的非编码小分子RNA(miRNA)可成为一种与神经网络结构相关的重要调节因子［3］。它们通过碱基互补与开放性阅读框架和mRNA的3′-UTRs结合从而导致mRNA降解和翻译抑制。miRNA在器官形成、新陈代谢和神经发育方面起着重要的作用。多种miRNA在大脑中选择性表达，并在神经元处理过程中表现为最基本的调节作用，包括维持神经元的转录、树突的长出和触突的形成［4］。国外学者关于miRNA和SZ的相关研究已有大量文献报道，但这些研究绝大部分都是基于SZ患者死亡后尸检组织中异常miRNA的研究，外周血几乎未涉及。Lai［5］等在2011年用外周血单个核细胞检测出发现了7个miRNA(hsa-miR-34a、miR-449a、miR-564、miR-432、miR-548d、miR-572和miR-652)特征谱，该试验表明这7个异常表达的miRNA可作为诊断SZ的生物标志物。

Gilad等［6］证实血清miRNA的变化可以反映人体病理生理状况的改变。Chen等［7］报道miRNA可以在血液中稳定的独立于血细胞之外的存在，血清中特定的miRNA可以作为肿瘤或其他疾病的诊断标志物。Evan等［8］报道了使用qRT-PCR方法分析血清中循环miRNA。因此本研究对SZ患者血清miRNA表达谱进行了研究。

本试验通过芯片筛选、PCR验证。与健康受试者比较，在未接受过抗精神病药物治疗的SZ患者血清中发现了3个差异表达的miRNA，其中hsa-miR-1281高表达，hsa-miR-638和hsa-miR-2861低表达，表明了SZ患者血清中存在异常表达的miRNA。由于本试验是首次通过芯片筛选SZ血清中差异表达的miRNA，目前尚未了解异常表达的miRNA在SZ患者血清中的具体作用机制。文献检索未发现差异miRNA在SZ中的相关报道，但筛选出的部分miRNA在大脑发育以及神经紊乱性疾病中的调控作用已有不少报道［9-14］。

Mukhopadhyay等［9］用包含609种鼠miRNAs的miRXploreTM技术分析了妊娠8.5d、9d和9.5d的老鼠胚神经中miRNA表达，结果发现正常神经管形成的关键时期存在着一系列独特的miRNA基因表达谱，其中miR-638、miR-663、miR-762可能在胚神经发育中存在关键的调节作用。Maes等［10］也阐明了miR-638、miR-663可作为神经管发育中起关键作用，在神经管发育过程中细胞内增殖和凋亡的一个重要的调节因子。Santosh等［11］通过基因库预测该疾病的疾病通路基因分析发现包括miR-638、miR-1469在帕金森病患者中有异常表达，可能在该病信号通路调控中有重要的作用。而从SZ的病因学［12］和影像学研究［13-14］提示神经发育障碍可能是其发病机制之一，在基因和环境的共同影响下，大脑的正常发育受到不良影响，包括神经元细胞的分化、迁移和凋亡等过程受损，使得在青春期大脑机能成熟的最后阶段出现各种神经精神障碍。这一点结合miR-638的研究成果分析，认为低表达的miR-638可能与SZ发病机制和临床症状有关。

通过靶点的预测，发现组蛋白脱乙酰化酶5(histone deacetylase 5，HDAC5)是miR-2861在mRNA水平上的一个靶点。HDAC5在大脑前额的海马体、脑皮质和杏仁核等区含量极为丰富，在提高学习、记忆和突触构建方面有着重要的意义［15］。而有研究发现，可以通过HDAC5抑制剂参与脑皮质神经元中脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor，BDNF)表达的调控［16］。BDNF对于大脑皮层的发育和成熟具有突出的作用。特别是在大脑发育期间其表达失调会导致神经网络结构的紊乱，在成熟大脑中是引起适应能力下降的一种潜在机制，使得大脑对神经毒性的损伤更加敏感。尽管miR-2861与其靶点HDAC5在SZ中的具体作用机制还未见报道，但这些研究结果提示miR-2861的异常表达可能和SZ的发病机制有关。

通过靶点的预测发现hsa-miR-638、hsa-miR-2861和hsa-miR-1281分别存在246、47和31个靶基因。但是由于时间和经费有限，目前还没有对筛选出的miRNA进行靶点的验证，以及这些miRNA和临床症状的研究。研究将在后续的工作中将加大标本量对筛选出的miRNA进行靶点验证和体外试验，探索与SZ机制相关性，结合临床病理资料分析其临床意义。综上所述，SZ患者血清中存在异常表达的miRNA，可能是诊断SZ的一个新的标志物，但其作用机制还需进一步的研究探讨。

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