通过慢病毒载体构建SSA/Ro52稳定基因沉默细胞系

郭　娟，周　炜

(北京大学第一医院风湿免疫科，北京 100034)

ChinJAllergyClinImmunol，2014，8(3)：216- 220

核糖核酸(ribonucleic acid，RNA)干扰是近年来发展起来的特异性抑制基因表达的有效工具，被广泛用于功能基因组学的研究[9]。本研究利用全基因组RNA干扰库报道的SSARo52特异序列，由慢病毒载体转染Hela细胞[10]，建立SSARo52基因沉默细胞系，评价不同RNA干扰序列对基因表达的抑制效果，为近一步研究SSARo52功能创造条件。

材料和方法

载体和RNA干扰序列

使用慢病毒载体pLKO-puro(图1)，U6启动子表达短发卡(short hairpin， sh) RNA序列，可在多数细胞内持续高水平表达RNA干扰序列。质粒含有人pgk基因启动子表达嘌呤霉素(puromycin)抵抗基因，转染成功的细胞对嘌呤霉素抵抗，可以使用嘌呤霉素筛选得到纯化的转染细胞。

慢病毒颗粒产生及细胞转染

按照说明使用Fugene 6.0(Roche)将含有SSARo52特异RNA干扰序列的pLKO-puro质粒或对照质粒与表达与广泛真核细胞结合的水疱口炎病毒G蛋白的pVSV-G与逆转录酶和核心蛋白的pdelR89.1共同转染293T细胞。转染48与72 h后收集含有慢病毒颗粒的上清液，800 g离心20 min，-70℃冻存备用。

当6孔培养板中Hela细胞生长到50%至60%融合时，吸出培养基，加入新鲜培养基和含有慢病毒颗粒的上清液各1 ml，24 h后加入嘌呤霉素2 μgml；3 d后弃上清，胰蛋白酶消化后收集细胞。在部分培养孔中加入干扰素α(interferon α，IFN-α)5 000 Uml(PeproTech，USA)刺激细胞24 h后收集细胞。将细胞分为2份，分别裂解提取RNA和蛋白进行聚合酶链式反应(polymerase chain reaction， PCR)和免疫印迹(Western blot)检测。

图1慢病毒载体pLKO-puro

Fig1Lentiviral vectors pLKO-puro

hPGK：人磷酸甘油酸激酶真核细胞启动子；Puro：嘌呤霉素抵抗基因；SIN3’LTR：自灭活3’端长末端重复序列；AmpR：氨苄青霉素抵抗基因；5’LTR 5’：端长末端重复序列；小发卡结构RNA序列由RNA聚合酶Ⅲ启动子U6控制表达

表1　SSARo52短发卡RNA序列*

Table 1　Short hairpin RNA sequence of SSARo52

表1　SSARo52短发卡RNA序列*

克隆序列位置GC含量性质1TGGCATGGTCTCCTTCTACAA外显子7476%编码区2CTGCCTTCTTTATGGGACTTA外显子7429%3’UTR9TGAGAAGTTGGAAGTG⁃GAAAT外显子3381%编码区11AGTTATCCTATGGTCCTGGGT外显子7476%编码区

*引自参考文献[10]

使用Trizol(Life technology，USA)试剂提取细胞总RNA，随机引物逆转录为cDNA，使用SYBR Green PCR Kit(Qiagen)在ABI PRISM 7700(Applied Biosystem)进行定量PCR。SSARo52引物序列为Ro52-F(GAACTGCTGCAGGAGGTGATAA)和Ro52-R(AGTTCTGGAGAGGTAATATCCAGGTC)；内对照为GAPDH，引物序列为GAPDH-F(AGGGCTGCTTTTAACTCTGGTAAA)和GAPDH-R(CATATTGGAACATGTAAACCATGTAGTTG)。PCR条件为95℃ 15 s、60℃ 30 s、72℃ 30 s，40个循环。每次PCR同时扩增1、0.1、0.01、0.001、0.000 1倍梯度稀释的cDNA，根据各稀释倍数的Ct值建立标准曲线，计算样本中mRNA的相对含量。SSARo52 mRNA表达水平用同一样本中SSARo52与GAPDH mRNA相对含量的比值表示。

收集的细胞离心，弃上清，加入1 ml裂解液(Bio-rad)，超声振荡匀浆，离心后取10 μl上清，与2 μl上样缓冲液混合，进行十二烷基硫酸钠聚丙烯酰胺凝胶电泳(sodium dodecyl sulfate polyacrylamide gel electrophoresis，SDS-PAGE)。半干电转至醋酸纤维膜，5%脱脂奶粉PBS封闭，加抗SSARo52(R&D， MAB62191)或抗beta-actin(abcam， ab8227)室温孵育2 h，PBS加入辣根过氧化物酶标记二抗孵育30 min，化学法光法(ECL)(Amersham Biosciences)曝光检测。凝胶成像系统(Bio-Rad)扫描显影条带，计算光密度值。SSARo52蛋白表达水平由SSARo52条带光密度值与actin条带光密度值比值表达。

统计学处理

结　　果

慢病毒载体转染Hela细胞后进行抗生素筛选，得到均一转染细胞。含shRNA表达框架的病毒序列可以整合至细胞基因组，形成稳定细胞系。克隆1、2、9、11转染细胞SSARo52蛋白表达水平均有不同程度下降(图2)，分别是对照克隆S转染细胞的5%、50%、10%和80%。其中克隆1和9抑制作用最明显。传代培养4周后收集细胞免疫印迹检测SSARo52蛋白表达，上述克隆转染细胞SSARo52蛋白表达水平没有明显变化。

对mRNA的检测也得到相似结果，克隆1、2、9、11转染细胞SSARo52 mRNA相对含量与GAPDH的比值分别是0.055、0.067、0.028、0.166(图3)，与对照克隆S转染细胞SSARo52 mRNA表达水平0.215相比，分别为25.5%、31.2%、13.0%和77.2%。克隆9的抑制作用最明显。

IFN-α影响

图3转染短发卡RNA克隆的Hela细胞中SSARo52 mRNA表达水平的抑制程度

Fig3The degree of SSARo52 mRNA expression inhibition in Hela cell

讨　　论

慢病毒载体转染细胞后其表达框架可以整合到宿主细胞基因组中，使得RNA干扰序列得以持续表达。抗生素筛选后可以得到稳定转染细胞系。本研究使用表达SSARo52特异sh-RNA序列的慢病毒载体转染Hela细胞，在传代培养后SSARo52表达水平持续降低，提示既得到了稳定的SSARo52基因沉默细胞系。在人细胞中，SSARo52除了具有IFN负性调控作用外，还在防御细胞内病原体[8]发挥重要作用。此外，SSARo52还具有调控细胞增殖[12]和凋亡[13]的作用，但其相关机制尚未阐明。本研究所建立的SSARo52基因沉默细胞系，可以用于探讨SSARo52在感染防御与免疫调节中的作用。由于克隆1和9对SSARo52的抑制程度不同，比较不同克隆转染的细胞的效应，不但可以防止目的基因外作用(off-target effect)对实验结果分析的影响，还可以在一定程度上量化地探讨基因表达水平差异的作用。

(本文图2、4见封三)

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