miR-17在结肠癌中的表达及其临床意义

桂 亮，王太洪，张弘伟，卢有胜

microRNA(miRNA)是一种长约22 nt的非编码RNA通过与靶基因RNA的3’-UTR区5～8个碱基的完全或部分互补结合来负调控靶基因的表达[1-3]。microRNA在多种生物学过程中起作用，包括发育、分化、凋亡和癌症等[4-6]，到目前为止，已经有近400个人类miRNA被发现，并且推测人类中1/3的基因都受到miRNA的调控。目前研究认为，miRNA可通过类似癌基因、抑癌基因或其他方式调控肿瘤的发生、发展和转归过程，是近年来肿瘤学领域研究的热点之一。结肠癌是最常见的消化道恶性肿瘤之一，其发病率和死亡率均居高不下。结肠癌的发生发展过程与癌基因、抑癌基因、细胞凋亡及细胞因子等多种基因表达异常密切相关。近年来随着miRNA研究的深入，结肠癌与miRNA的关系日益受到关注[7-8]。近来，有研究报道miR-17～92簇在结肠癌组织中表达失调[9-10]，提示miR-17～92簇可能参与结肠癌发生发展过程。但是miR-17～92簇中各成员对结肠癌的作用及机制至今尚未阐明。本研究采用实时real-time PCR技术检测miR-17人结肠癌组织的表达水平，初步探讨miR-17异常表达与结肠癌发生发展的关系及其作用。

1 资料与方法

1.1 一般资料 收集本病区2012年1月至2013年6月收治的经术后病理证实的50例结肠癌患者手术标本。其中男32例，女18例，年龄29～88岁，平均57岁。每例标本均有癌旁正常黏膜作为对照，所有患者术前均未行放、化疗，手术切除标本后立即放人液氮冷却，再转移至-70 ℃冰箱长期保存。

1.2 试剂材料 RNAiso Plus试剂、Reverse Transcription System试剂盒和SYBR Premix ExTaqTM试剂盒购自TaKara；miR-17和内参snU6引物由南京凯基生物公司设计合成。

2 方法

2.1 RNA的提取 结肠癌组织及癌旁组织总RNA的提取采用RNAiso Plus试剂一步提取法，具体步骤参照说明书，提取的总RNA置于-70 ℃保存。

2.2 转录反应 步骤参照说明书，miR-17，U6使用特异性RT引物，反应条件为42 ℃，15 min，85 ℃，5 s。

2.3 实时荧光定量PCR 20 μl反应体系参照说明书，在96孔荧光PCR仪(7300型，美国ABI公司)上进行扩增．反应条件为：95 ℃ 30 s预变性；95 ℃ 5 s，60 ℃ 31 s，40个循环。反应结束后计算得到各反应管Ct值。通过2-△△Ct法计算实验组目的基因的表达相对于对照组的变化倍数，△△Ct=(Ct癌组织-Ct内参)-(Ct癌旁组织-Ct内参)。

2.4 统计学处理 应用SPSS13.0统计软件，统计学方法为计量资料采用t检验；计数资料采用χ2检验，以P<0.05为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 miR-17在结肠癌组织及正常组织中的表达 miR-17在结肠癌组织及正常组织中的表达见图1，结肠癌组织中miR-17表达量较正常组织明显降低(P<0.05)。

图1 结肠癌与癌旁组织中miR-17的表达水平

3.2 miR-17的表达情况与临床病理特征的关系 具体数据见表1。如表1所示，miR-17表达下调与TNM分期以及浸润深度有关(均P<0.05)，而与性别、年龄、肿瘤直径、淋巴结转移及远处转移均无相关性(均P>0.05)。

表1 miR-17的表达情况与临床病理特征的关系

4 讨论

本研究证实了miR-17在人结肠癌组织中表达明显下调，在癌旁组织中高表达，而且其表达变化与TNM分期以及浸润深度有关，而与肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤的直径、淋巴结转移和远处转移均没有明显相关性。这提示miR-17在结肠癌发生发展过程中可能具有抑癌基因的作用，miR-17可能直接参与调控早期肿瘤的发生和转化。miR-17～92簇最早发现其在B淋巴细胞瘤[11]和肺癌[12]中高表达，是最早发现的具有癌基因作用的miRNA，因而被命名为“Onco miR-1”。与我们研究结果一致的是，有研究发现miR-17～92簇在乳腺癌、肝癌等由于所在染色体的杂合性缺失而出现表达量降低。最近研究发现，miR-17/20a可通过抑制AIB1、IL-8、CyclinD1等抑制乳腺癌的转移，从而扮演了抑癌基因的角色[13]。近来，有少量文献报道miR-17～92簇参与了结肠癌的发生发展过程[9]，Tavazoie等[14]研究发现在人结肠癌组织中miR-17～92簇的表达水平与其基因所在基因组的位点13q和c-myc表达密切相关，他们的研究结果显示只有当肿瘤组织中13q稳定存在时，miR-17～92簇的表达水平明显增加，而在13q缺失的肿瘤组织中则未检测到miR-17～92簇的表达。而Tavazoie等的研究是随机比较了人55例结肠癌组织和10例癌旁组织中miR-17～92簇的表达，因而研究并不能够很好的反映肿瘤发生早期的miRNA表达谱变化。而在我们的研究中，我们在比较了50例相互匹配的人结肠癌组织和癌旁组织中miR-17～92簇的表达变化，发现其在癌旁组织中明显高表达，但其表达水平变化与肿瘤的进展无明显相关,而且我们所检测的标本中大多数为早期肿瘤标本。

综上所述，本研究证实了miR-17在结肠癌组织表达下调，其表达变化与TNM分期以及浸润深度有关，而与肿瘤患者的性别、年龄、肿瘤的直径、淋巴结转移和远处转移均没有明显相关性。据此，我们推测miR-17可能在结肠癌发生早期具有重要的调控作用，具体机制尚待进一步研究。

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