先天性马蹄内翻足病因的研究进展

司晓凤，叶姣，王玉辉，曹琳，王正东

(1.沈阳医学院基础医学院临床医学专业2011 级1 班，辽宁 沈阳 110034;2.口腔医学院2011 级1 班;3.基础医学院临床医学专业2010 级1 班;4.基础医学院解剖学教研室)

先天性马蹄内翻足 (congenital club foot，CCF)是一种常见的小儿骨科疾病，发病率为0.064%～0.8%，致残率高，占足部畸形发病率的85%，在其病因、病理和发病机制方面的研究虽然取得了一些进展，但至今仍看法不一。在临床上，试图通过矫正马蹄内翻足的外观来达到功能的改善，近几年有大量的关于Ponseti 方法［1］的研究，但是依然存在不能矫正的情况，同时由于病因尚不明确，临床治疗还有很大困难。近几年，大多数的学者主要对其遗传因素做一定的研究，本文就着重于此种疾病的遗传因素的研究来做简要综述。自1803年Scape 首次研究CCF 的病因以来，目前对CCF 病因的研究主要有以下几个方面。

1 神经肌肉病变

有学者认为肌力不平衡可以直接导致CCF 畸形的发生。Omeroglu等［2］通过研究CCF 畸形的脚部肌肉并在光镜下检测两个肌纤维的大小和在肌肉组织纤维化的定量分析来确定肌肉的萎缩程度，最终推测出CCF 脚部肌肉萎缩和纤维变性的原因可能是由于宫内高位脊膜膨出所致。陈秋等［3］通过对神经电图以及体感觉诱发电位测定外周向中枢传导的异常并寻找神经病变的位点，探讨神经电生理异常与CCF 畸形的关系，发现76.2%CCF患儿存在不同类型及不同程度的神经电生理异常，此异常多存在于脊髓腰4 以下节段。通过体感觉诱发电位和神经电图检测显示，神经电生理异常与CCF 畸形严重程度相关。这一结论支持CCF 神经病变学说，证明CCF 有神经肌肉改变的存在。Ippolito等［4］使用交互式图像分析仪来分析在13 和19 周终止妊娠的CCF 的患者的腿的横截面的腿部肌肉，包括整个横截面，肌肉组织、脂肪组织、胫骨、腓骨，以及其他软组织(肌腱、神经、血管)的测量，发现腿部肌肉萎缩是CCF 的一个病理成分。这一研究也充分证明了CCF 与肌肉的相关性。刘卫勇等［5］对3 组128例小儿(单侧CCF组44例患儿、双侧CCF 组19例患儿和对照组65例小儿)小腿比目鱼肌、胫骨后肌、腓肠肌内侧头、腓肠肌外侧头及胫骨前肌肌肉的厚度行超声测量，发现CCF 患儿患侧小腿肌肉的厚度变薄，肌肉内部回声增强，超声测量肌肉厚度比超声目测肌肉回声改变对评估CCF 患儿小腿肌肉萎缩更为敏感。

杨晓颜等［6］采用十通道生物机能实验系统来采集32例单侧CCF 患儿的下肢表面肌电信号，发现患侧的小腿肌肉受累，健侧与患侧胫前肌、腓肠肌在背伸位、跖屈位平均RMS 值差异有统计学意义(P ＜0.05)，且患侧胫前肌、腓肠肌肌电信号均较健侧低，最终得出结论:CCF 患儿存在神经、肌肉功能异常，表面肌电图检测可以无创地了解患儿的神经及肌肉功能。

2 骨骼发育异常

Gilbert等［7］使用免疫组化方法对CCF 足跟骨研究发现软骨细胞较小，未分化成熟，细胞外黏蛋白减少，生长软骨类似关节面软骨，骨化中心骨化异常可导致骨骼发育畸形。李增刚等［8］提取单纯性马蹄内翻足畸形胎鼠及正常对照胎鼠脊髓总蛋白，进行双向电泳;经PDQuest 软件分析，选择差异点进行质谱鉴定，采用生物信息学方法来分析结果，结果经双向电泳分离后，畸形胎鼠与正常对照组相比，脊髓组织的烯醇化酶没有表达，微管蛋白表达下调，载脂蛋白表达上调，ATP合酶F1 复合体组装因子2 (Atp12p)额外表达，总结出马蹄内翻足大鼠模型踝部组织 (去除皮肤)、踝部骨骼及脊髓多种蛋白质存在表达差异。

3 软组织挛缩

赵东风等［9］发现CCF 细胞外基质的改变符合组织器官纤维化及一般瘢痕性纤维结缔组织增生。故认为CCF 可能为足内侧的纤维化所引起，他们主要对15例CCF 患者及对照组5例非神经、肌肉及胶原病死亡小儿，足内侧及小腿前外侧深筋膜的Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原进行免疫组化研究。切片应用LeticaQ5 70c 彩色图像分析仪处理系统进行量化分析，并经统计学处理。结果是CCF 挛缩侧Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原含量均有增加，Ⅰ型胶原增加最显著，Ⅲ型次之，Ⅱ型增加最少，且Ⅰ、Ⅲ型胶原呈负相关。Ⅱ型胶原的阳性表达可能为伴随现象，它与Ⅰ、Ⅲ型胶原无相关性。CCF 细胞外基质的改变符合组织器官纤维化及一般瘢痕性纤维结缔组织增生。故认为CCF 可能为足内侧的纤维化所引起。

4 血管异常

一些学者对CCF 患足进行血管造影发现足部均有血管异常，跗骨窦区血运贫乏，血管排列紊乱，并且在胎儿早期血管改变已经很明显。Stolter等［10］和Kanfman等［11］均应用绒毛膜绒毛取样的方法，来建立肢体畸形动物的模型，经过研究发现所有的疾病中马蹄内翻足发病率最高，这是由于血管断裂或发育缺陷以及发生缺血或血栓形成导致缺氧，影响胚芽的形成，最终导致马蹄内翻足的产生。Werler等［12］使用爱荷华注册表收集先天性和遗传性疾病的人群为基础的监测数据，检查分离从1997年到2005年的住在爱荷华州的同一时间段分娩的677个马蹄内翻足和2 037例非畸形的母亲，发现，血管破裂可能导致马蹄内翻足的发生。

5 遗传因素

CCF 的发病率就种族、性别而言差异显著，并且随着患病亲属的增加而增加，这提示其患病率至少部分受到遗传因素的影响。不同种族其患病率不同，中国人0.39%，高加索人1.2%，波利尼西亚人6.8%。CCF 的遗传模式被称为复合性遗传，其特点包括:多基因遗传和非遗传因子(环境毒物、病毒等)。其有一个主要的基因，但受到其他因素如其他基因的影响、环境的调控［13］。近几年来，有一半以上的学者主要对这一方面进行研究。国外的Dobbs等［14］与Alvarado等［15］均发现Pitx1 可能是导致CCF 发生的致病基因。在国内，杜香平等［16］也发现与此基因相关的内容，他们采用RT-PCR 方法检测89例患儿腓肠肌组织的Pitx1基因，其中CCF 患儿55例，正常对照组34例。PCR 扩增后，将所有Pitx1 基因进行基因测序。结果发现:将Pitx1 基因测序结果用Blast 软件进行分析后发现，Pitx1 基因中的第781 碱基G 突变为A，在89例患儿中，有14例发生了上述突变，全部为CCF 患儿，正常对照组未发现，χ2检验对实验数据进行分析得到差异有统计学意义，所以得出的结论为:Pitx1 基因突变可能是CCF 的致病原因之一。另外，Dobbs等［14］和Alvarado［17］也都研究了T-BOX 的转录因子TBX4 的17q23.1q23.2 区与Pitx1 有关。Wang等［18］的实时定量RT-PCR 检测发现全反式维甲酸的Pitx1，Sox9 和Col2al 的mRNA 的表达明显下调。此外，他们采用免疫荧光显微镜和Western 印迹检测表明，Pitx1 主要表现在软骨结节的Pitx1，Sox9 和Col2al 的水平也依赖ATRA 剂量而下调。结果表明，全反式维甲酸可能会通过降低抑制软骨特定的分子，如Sox9 和Col2al 的后腿肢芽间充质细胞的软骨形成，通过下调Pitx1 表达。Wang等［19］在对SOX9 mRNA 和蛋白表达水平检测分析时，发现CCF 的肌肉样本明显高于对照组的数值。根据本现象采用PCR 和Western 印迹，推测在遗传CCF 的病因中，SOX9基因的过度表达可能发挥作用。Cao等［20］利用RTPCR、免疫组化和Western 印迹的方法分析大鼠Enl 与单纯性先天性马蹄内翻足 (idiopathic congenital talips equinovarus，ICTEV)的相关性。经P-Match 软件预测，Gli3 基因启动子区域有3个转录因子En1 的可能结合位点，经ChIP 实验证实位点1 是真正结合位点。3 种方法都证实En1 基因在马蹄内翻足模型鼠中表达下降，结果提示大鼠的转录因子En1 可能是Gli3 基因的上游负调控元件。在ICTEV 患者中，很可能是由于EN1 基因表达水平的下降导致了Gli3 基因表达水平的上升，最终导致ICTEV 的发生。2年之后，Gao等［21］又用PMatch 软件预测Gli3 基因上游序列中转录因子的结合位点，并通过染色质免疫沉淀实验、凝胶迁移实验验证。用RNA 干扰实验以及构建Hoxd13 表达载体，观察其在L6 细胞中对Gli3 基因表达的影响。结果发现 在大鼠Gli3 基因序列的启动子区域发现2个Hoxd13 的结合位点，染色质免疫沉淀和凝胶迁移实验证实Hoxd13 结合于结合位点2 上。Hoxd13 表达下调时，Gli3 基因表达明显上调。Hoxd13 基因表达上调时，Gli3 基因则表达下调。因此得出结论为在大鼠胚胎肢体发育中，Hoxd13蛋白可能与Gli3 基因启动子区的Hoxd13 结合位点2 结合，调控Gli3 的表达。刘丽英等［22］经过实验发现88% (22/25)的ICTEV 患者COL9A1 蛋白表达阳性，明显高于正常对照组。位于COL9A1基因编码区的SNP 位点rs1135056 的基因型频率和等位基因频率在2 组人群中的分布差异有统计学意义:ICTEV 组G等位基因频率高于对照组;与对照组相比，AA 基因型频率降低，AG、GG 基因型频率增高。因此，COL9A1 基因在ICTEV 中高表达，rs1135056 多态位点G等位基因与ICTEV 的发生相关。关于COL 家族的其他基因的研究，也有一些进展:李国平等［23］采用PCR 法对16例患有CCF 患者的COL1A5 基因进行扩增、纯化后直接检测，并分析其临床意义发现:有1例患者基因组中的COL1A5 基因存在C ＞T 的突变，突变患者具有较为典型的遗传家系，呈现遗传早现现象。从而得出结论COL1A5 基因突变与CCF 存在明显的关系。赵宁等［24］检测20例单纯性马蹄内翻足患儿下肢肌肉及肌腱组织中COL1A1 基因mRNA 的表达，根据COL1A1 基因转录调控区-1 031 bp～+30 bp 及第1 内含子的序列，设计8 对引物，半定量RT-PCR 结果表明，与正常对照组相比，单纯性马蹄内翻足患儿患侧肌肉及肌腱组织中COL1A1基因表达水平明显上调;经PCR-DGGE 筛查并测序发现1例患者存在-161 (C→T)的杂合变异，另1例患者存在+274 (C→G)的纯合变异。二者均为新发现的变异，因此提示COLlAl 基因转录调控序列变异可能是单纯性马蹄内翻足的致病原因之一。关于HOX 家族与马蹄内翻足的病因的关系，Ester等［25］发现单独的HOX 基因不能导致马蹄内翻足的发生，最终得出结论HOXA，HOXD，IGFBP3 与SNP 位点在线粒体介导的凋亡基因共同决定了马蹄内翻足的发生。除了这些可能相关的基因外，Gurnett等［26］也排除了TNNT3，MYH3，TPM2 这3 种基因对马蹄内翻足的影响。

6 其他因素

除了以上几个原因之外，也有少数研究者支持以下的几个结论:Sreenivas等［27］在不到1个月年龄的54例患者父母中，使用Dimeglio 分类对血缘和91 只脚进行了其严重性的评估，推测血缘可能是在其发展中的致病因素之一。Sahin等［28］于2009年和2011年间在土耳其东部城市的农村进行ICTEV 筛查的病例对照研究，共28例和575 名对照(健康婴儿)。在进行回归分析中得出结论:近亲结婚会增加ICTEV 的风险。Werler等［12］也发现与肥胖有关的致病因素导致马蹄内翻足的发生。

7 不足与展望

马蹄内翻足的致病机制是相当复杂的，至今还没有定论，因此在临床上对它的治疗也有一定的困难。同时我们也很容易看出这些致病因素相互制约，似乎暗示不只是一个致病因素可以导致马蹄内翻足的发生，至少在一些病例的表现型可以看出，这可能是由于不同因素的共同作用所致:例如环境和基因的作用，基因在骨骼和软组织形成过程中的未知的作用以及基因之间的相互作用。因此，遗传基因是否为马蹄内翻足发生的根本原因也还需继续探讨，同时，也有待于使用更先进的技术方法进行深入研究。为临床ICTEV 的产前诊断、基因诊断、基因治疗提供依据，降低先天畸形婴儿的出生率。

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