用于免疫荧光染色的大鼠视网膜冰冻切片的制作体会

郭岩，孔佑华，王凤琴

(1.济宁医学院组胚教研室;山东 济宁 272067;2.形态学实验室)

眼由眼球壁和玻璃体等内容物构成，各部分组织类型及硬度差异显著，这一特点导致眼组织切片制作有一定困难。视网膜分布于玻璃体周围及后方的眼球内壁，其视部为高度特化的神经组织，独立而规则的视网膜标本不易得到。因此，本研究将取材的眼球标本给予2 种不同处理，以得到组织形态和细胞排列相对规则的杯状视网膜，通过不同厚度切片比较，最终得到适合免疫荧光染色的优质切片，现将具体实验方法及体会描述如下。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 实验动物 实验用SD 大鼠30 只，体重约(200 ±20)g，雌雄不限，正常喂食和饮水，12 h明暗交替光照。由济宁医学院实验动物房提供。

1.1.2 主要试剂 生理盐水、蔗糖、水合氯醛(上海医药集团);4% 多聚甲醛 (PFA)、0.1%PBS、OCT 包埋剂(Sigma 公司);CD31 和GS 抗体(Abcam 公司)。

1.1.3 主要仪器 CM1900 冰冻切片机(Leica 公司);体视显微镜(SMZ168，Motic);IX71 荧光显微镜、IX7 倒置荧光显微镜、DP70 显微数码摄像机(Olympus 公司)等。

1.2 方法

1.2.1 固定前眼球标本的2 种不同处理方式(1)灌注取眼球方法:取SD 大鼠称重，10%水合氯醛以0.4 ml/100 g 腹腔注射麻醉。迅速打开胸腔充分暴露心脏，套管针刺入左心室并进针到升主动脉，取出内芯，连接生理盐水快速灌注，同时剪开右心耳。当其流出液体变为淡粉色至无色后更换为4%多聚甲醛灌注。摘除大鼠眼球，部分置于改良眼球专用固定液Kolmer 液(5%重铬酸钾4 份，10%甲醛4 份，冰醋酸1 份、三氯醋酸1份、10%醋酸钠1 份)［1］;部分以4%多聚甲醛固定。(2)不灌注直接取眼球方法:SD 大鼠称重后10%水合氯醛以0.4 ml/100 g 腹腔注射麻醉。直接摘除大鼠眼球，部分置于改良眼球专用固定液Kolmer 液，部分置于4%多聚甲醛固定液。

1.2.2 固定 根据固定前眼球标本的2 种不同处理方式，采取不同的固定时间。(1)在体视显微镜下，于角巩膜缘水平剪开眼球，吸除晶状体、玻璃体，于4%多聚甲醛中固定2 h。(2)角膜剪小口，4%多聚甲醛中固定6 h。将固定后的标本投入10%蔗糖进行脱水处理。待标本于10%蔗糖溶液中下沉至容器底部后，换至30%蔗糖溶液，4℃过夜。

1.2.3 包埋与冷冻 脱水后标本以视神经根部为标志，水平或垂直方向放置，以便得到视网膜横切面和纵切面，分别放入小橡皮塞或适当容器，OCT 胶充分包埋，若眼球处理时已去除玻璃体，为避免气泡产生可将OCT 胶滴入视杯中［1］。编写样本序号，液氮速冻，放置－80 ℃冰箱贮藏，待2 周后标本集齐分批次处理。

1.2.4 切片与贴片 针对视网膜组织属性将冷冻箱温度调节至－20 ℃，标本头温度依次调节至－15 ℃与－20 ℃。待实际温度降至相应数值时，快速从－80 ℃取出标本块，以双蒸水将其固定于冷冻架上的标本托，按序号顺序置于标本盘中。将标本固定于标本头，按下位于机箱左上方的粗进料按钮，依次调节厚度为6、8、10、12 及14 μm，转动手柄将标本移向刀片，边观察边将组织块修整至恰当平面。适当调节防卷板位置，一般情况比刀刃稍微超出约1.5 mm 为宜，也可视情况而定。

待观察到较大“C”字形视网膜结构时开始贴片收集至黏附性载玻片。收集贴片时采用常温载玻片。切片后将防倾板打开的同时迅速以载玻片靠近吸附，通常即会得到紧密贴附舒展的视网膜组织，若未能紧贴，需将载玻片放置在冰冻切片机玻璃箱盖片刻即可。将收集到的切片整齐同向排列于载玻片，以3～4 样本/片为宜。

1.2.5 免疫荧光染色 按照免疫荧光染色步骤进行操作，于荧光显微镜下观察比较不同取材方法和不同厚度冰冻切片的荧光染色效果。

2 结果

组织形态观察:(1)取材时采用去除玻璃体处理的视网膜组织形态弧度不甚圆滑，但大部分细胞层次规律。免疫标记清晰，荧光抗体激发状态良好，以10 μm 和12 μm 厚度的样本为最佳。(2)取材时采用保留玻璃体者，大多数视网膜圆滑无皱褶，各层细胞排列规律，结构清晰，保持了视网膜基本形态，偶尔见组织牵拉。与保留视杯标本相比，同样厚度切片免疫荧光激发明显减弱，也是以10 μm 和12 μm 厚度的样本为最佳。

3 讨论

有学者不建议对动物进行灌注固定，认为以4%多聚甲醛灌注大鼠心脏时，渗透到视网膜各层的多聚甲醛，因局部组织液和血液的缺失而浓度过高，使该部分组织发生强烈收缩而导致结构改变，失去其原貌［2］。另外，由于视网膜不同层次之间毛细血管密度不同，使得不同浓度的多聚甲醛产生不同收缩力，导致组织细胞聚集、层次分离和着色不均等后果，不利于后期免疫荧光标记研究。本研究分别对灌注固定取材和未灌注直接取材的视网膜进行同样厚度的冰冻切片和血管内皮免疫荧光标记，镜下观察未发现明显毛细血管差异变化。因此，灌注固定或许会影响视网膜色素上皮层及其他神经细胞层，但针对视网膜血管研究并未造成显著影响。李慧等［3］认为切片放置时间不宜超过30 d，否则冰冻切片的抗原性质会发生改变，影响实验的科学性和准确性。本研究在2 周内进行免疫荧光标记。据王秀萍［4］报道，细胞排列致密且较硬的组织，冰冻切片的温度应控制在－16～－20 ℃;细胞排列疏松且较软的组织，冰冻切片的温度控制在－20～－22 ℃;脂肪组织冰冻切片的温度控制在－22～－24 ℃可以获得良好的切片效果。本研究标本头温度依次调节至－15 ℃与－20 ℃。

视网膜存在于眼球壁最内层，将眼球于角巩膜缘延赤道线剪开，吸除晶状体和玻璃体等内容物，即暴露视网膜，便于从固定液渗透、蔗糖脱水到抗体孵育不需要消耗较长时间就能达到良好的效果。实验中发现某些视网膜组织产生冰晶，令局部结构发生改变，影响标记位置和实验结果。把握好组织固定脱水的时间，或在脱水后立即进行液氮速冻是减少和消除冰晶的有效措施。有研究认为用液体冲洗后及时用滤纸吸干可减少冰晶产生［5］。包埋剂可采用进口OCT包埋剂或普通合成胶水，冷冻效果并无明显差异［6－7］。因此对于样本量较大的实验或临床病理科可以考虑以普通合成胶水代替OCT 包埋剂，从而节约实验或病理诊断成本。冰冻切片的目的是保持组织固有结构形态的同时还应尽量避免降低抗原性，以便成功标记，得到满意的实验结果，若采用石蜡切片，在做免疫荧光标记之前应先做抗原修复。

用于免疫荧光的组织标本应尽量保持其完整的固有形态，通过对目标结构的定性、定位以及定量，再现视网膜各成分的状态。实验者可根据需要选择最适合的眼组织取材方法、切片厚度等以便得到满意的最终效果。

［1］李晶晶，朱鸿，施彩虹.三种方法对大鼠视网膜固定效果的比较研究［J］.上海交通大学学报 (医学版)，2011，31(8):1105－1107.

［2］曾玉晓，陈中山，田春雨，等.动物眼视网膜冰冻切片制作方法［J］.眼科新进展，2007，27 (11):831－832.

［3］李慧，黄景阳，袁中瑞.提高脑组织冰冻切片质量的几点体会［J］.中国免疫学杂志，2012，28 (11):1019－1022

［4］王秀萍.冰冻切片制作中时间和温度的控制［J］.医学综述，2013，19 (22):4213－4214.

［5］邴鲁军，高英茂，郭雨霁，等.冷冻切片常遇到的问题及解决对策.［J］.医学信息，2006，19 (9):1631－1633.

［6］许平，王筱璨，陈奎生.快速冰冻切片制备方法的改进［J］.郑州大学学报(医学版)，2010，45 (2):241－243.

［7］黄小丽，张培谊，唐新萍，等.用普通胶水代替进口冰冻包埋剂进行冰冻切片的探讨［J］.中国医药导刊，2013，15:185.