空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18的B细胞抗原表位分析及功能鉴定

楼宏强，胡 野，王 岚，单小云，盛秀胜，高素华

空肠弯曲菌(Campylobacterjejuni)是引起人类急性腹泻常见的病原体之一，是全球范围内重要的人兽共患细菌性肠道病原菌，其感染率在世界各地普遍呈上升趋势。空肠弯曲菌感染可引起人类发热、急性肠炎和格林-巴利综合症(Guillain-Barrre syndrome, GBS)等，还可感染动物导致牛和绵羊的流产，火鸡的肝炎和蓝冠病，童子鸡和雏鸡的坏死性肝炎，雏鸡、犊牛、仔猪的腹泻等多种疾病[1-2]。

空肠弯曲菌引发的食品安全和食源性疾病问题日益突出，成为公共卫生关注的新焦点。通过建立快速有效的空肠弯曲菌感染检测诊断方法，可以为空肠弯曲菌感染的防治提供重要手段。血清学检测诊断方法以其简便、快速、特异性强等特点在空肠弯曲菌感染检测的研究中受到广泛关注。而且，血清抗体的检测结果对于空肠弯曲菌感染导致Guillain-Barrre综合征的病因分析具有重要价值[3-5]。

在致病菌感染宿主的过程中，外膜蛋白通过加强巨噬细胞对抗原的摄取，增强了淋巴细胞的活化，在免疫反应中表现出重要作用，被广泛用于病原体感染血清抗体检测及保护性疫苗候选抗原。由于蛋白抗原通过抗原表位与相应抗体或致敏淋巴细胞发生特异性结合而发挥免疫效应，通过使用特异性抗原表位或表位复合物作为抗体检测物可检测出特异性的免疫反应成分，避免非特异性反应产物所致的假阳性与交叉反应，从而提高诊断方法的特异性[6-8]。

空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18是由ompl8基因编码的分子质量为18 kD的外膜蛋白，该蛋白在弯曲菌属中普遍存在，为空肠弯曲菌感染的血清学检测方法建立提供了重要候选抗原[9]。本研究采用生物信息学技术对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18进行结构和分子特征分析，对其中可能存在的线性B细胞表位进行ELISA鉴定，以期为后续血清学检测方法的建立提供候选抗原和实验依据。

1 材料和方法

1.1数据库 空肠弯曲菌全基因组数据库(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/AL111168.1)和核酸序列数据库 GenBank/NCBI (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/) 由美国国家生物技术信息中心构建。蛋白序列数据库SwissProt和TrEMBL (http://ww.expasy.org/sprot/ 和http://www.expasy.org/TrEMBL/) 由欧洲生物信息学研究所建立[10]。

1.2OMP18蛋白结构分析 采用TMpred (Prediction of Transmembrane Regions and Orientation, www.ch.embnet.org/software/TMPRED-form.html)和TMHMM 2.0 (http://cbs.dtu.dk/serves/ TMHMM-2.0/) 预测蛋白中可存在的跨膜结构域；采用ProDom (http://prodes.toulouse.Inra.fr/prodom/doc/blast-form.html)和Pfam (http://plato.wustl.edu/hmmsearch.shtml)预测目的蛋白中存在的功能结构域；通过http://www.cbs.dtu.dk/services/BepiPred/对OMP18蛋白中可能存在的线性B细胞表位进行预测；采用DNASTAR/protean软件对目的蛋白中存在的二级结构、亲水性和抗原性进行分析。

1.3OMP18蛋白氨基酸序列保守性分析 采用http://www.ch.embnet.org/software/BottomBLAST.html?(EMBnet-CH/SIB) (Switzerland) 数据库对空肠弯曲菌omp18 基因编码的蛋白序列进行比对，参数选择：Protein database，Non redundant，Blosum 62。筛选出与其相似性较高的氨基酸序列在http://www.ebi.ac.uk/clustalw/ 进行同源性分析。

1.4OMP18蛋白线性B细胞表位的ELISA鉴定 OMP18线性B细胞表位多肽由上海英骏生物技术公司合成，并采用HPLC技术对合成多肽进行纯度分析。将合成的各表位多肽稀释至10 μg/mL包被96孔板，以兔抗空肠弯曲菌全菌抗体IgG为一抗(Pierce公司)，HRP标记羊抗兔IgG抗体为二抗(Abcam公司)，对各表位多肽与全菌抗体的结合反应力进行检测分析。

2 结 果

2.1空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18结构分析 经在线生物信息学软件分析表明，空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18中不存在跨膜结构，整个蛋白定位于菌体表面。蛋白功能结构域预测发现OMP18蛋白中存在OmpA结构域，与病原菌的粘附能力密切相关。二级结构分析发现，OMP18蛋白中存在3个线性B细胞表位，且具有良好的亲水性和抗原性(图1-图3)。

图1空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18跨膜结构预测结果

Fig.1TransmembranestructureanalysisoftheOMP18fromCampylobacterjejuni

2.2OMP18蛋白序列保守性研究 空肠弯曲菌omp18基因同源性比对结果发现，该基因序列仅保守存在于不同空肠弯曲菌菌株中。空肠弯曲菌00-2425，3488，NCTC11168，S3，IA3902，ICDCCJ07001，M1,81116,81-176，doylei269.97株中均存在omp18基因，且序列高度同源，相似度达99%(图4)。

图2空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18B细胞线性表位预测结果

Fig.2LineBcellepitopespredictionoftheOMP18fromCampylobacterjejuni

图3空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18亲水性、抗原性预测结果

Fig.3HydrophilicityandantigenicanalysisoftheOMP18fromCampylobacterjejuni

图4空肠弯曲菌omp8基因核苷酸序列进化分析

Fig.4PhylogeneticanalysisoftheCampylobacterjejunibasedontheomp18gene

2.3ELISA检测结果 我们基于ELISA技术对预测的3个B细胞线性表位进行鉴定，结果发现3个表位抗原都能有效结合空肠弯曲菌全菌抗体(图5)，其中抗原表位多肽3对抗体的亲和力最强，为优势线性B细胞抗原表位。结果表明本研究所采用的预测分析方法可靠。

图5空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18B细胞线性抗原表位ELISA筛选鉴定结果

*：与空白组和阴性组比较P<0.05

Fig.5ELISAidentificationofLinearBcellepitopesfromtheOMP18ofCampylobacterjejuni

The “*” symbol indicate a significant difference (P< 0.05), compared with the Blank and Negative control groups.

3 讨 论

我国近年监测结果表明，腹泻患儿空肠弯曲菌检出率为4%～17.7%，成人腹泻检出率为3.85%～9.61%。空肠弯曲菌感染性腹泻发病率在许多国家居细菌性腹泻的首位，部分国家也仅次于志贺菌或沙门菌。空肠弯曲菌引起的食源性感染已成为重要的公共卫生问题。快速准确地检测空肠弯曲菌对于预防和控制空肠弯曲菌病的暴发流行，感染患者的早期治疗以及严重并发症的防治均有重要意义[1-2]。由于空肠弯曲菌营养要求高，培养条件特殊，传统的检测方法费时费力，因此，国内外学者对其检测方法进行了许多探索性的研究。

近年来，核酸分子杂交技术和PCR等分子生物学检测方法取得了很大进展，国内外已先后开展了一些针对空肠弯曲菌的基因检测，针对的靶基因主要包括16SrDNA、3SrDNA、hipO、鞭毛蛋白基因(flaA或flaB)等。基于PCR扩增技术的检测方法建立，为核酸水平检测空肠弯曲菌提供了快速而有效的手段。血清学检测诊断方法以其简便、快速、特异性强等特点在空肠弯曲菌感染检测的研究中也受到广泛的关注。而且，血清抗体的检测对于空肠弯曲菌感染导致Guillain-Barrre综合征的病因分析具有重要价值[11-13]。

外膜蛋白通过加强巨噬细胞对抗原的摄取，增强淋巴细胞活化，在免疫反应中表现出重要作用，被广泛用于病原体感染血清抗体检测并作为保护性疫苗候选抗原[14]。如从痢疾志贺氏菌I型中提纯的OMP免疫小白鼠可产生抗体，经ELISA检测，该抗体不仅可与该菌OMP产生强烈反应，而且能与痢疾志贺氏菌的整个细胞产生反应。Zhang等从空肠弯曲菌ATCC29428株中克隆到1个编码18 kd外膜蛋白(OMP18)的基因，并在大肠杆菌中进行了表达。通过对空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18序列进一步分析和研究，我们发现其含有一个由165个氨基酸组成的开放阅读框，序列比对结果显示各空肠弯曲菌OMP18氨基酸序列同源性达95%以上，保守存在于各菌株中。因此，可以为血清学检测提供有效的抗原。

OMP18蛋白结构分析结果显示该蛋白定位于细菌外表面，存在3个明显的B细胞线性表位，且具有显著的抗原性。基于ELISA技术，采用空肠弯曲菌全菌抗体对预测表位进行鉴定发现3个表位多肽都能与全菌抗体有效结合，但结合力存在差异。这说明本研究所使用的结构分析技术可靠，在表位预测方面准确率很高，也可用于其它蛋白的分析和研究。ELISA技术可以有效用于抗原表位的筛选，为本研究中优势表位的筛选鉴定提供了重要手段。

综上所述，本研究基于空肠弯曲菌主要外膜蛋白OMP18跨膜结构预测，线性B细胞抗原表位预测及序列同源性比对等生物信息学分析，通过ELISA技术对优势抗原表位进行筛选鉴定，为后续空肠弯曲菌感染的血清学方法建立及疫苗研发提供候选抗原，也为其它相关研究提供了有效的科研思路，具有重要的学术价值。

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