改良法对NSCLC患者癌组织及外周血K-ras基因常见突变位点的检测

李学琴，张露萍，徐燕梅，彭丽娜，孙建国，陈正堂

肺癌是当今世界发病率、死亡率最高的恶性肿瘤，其中80%～85%为非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)。近来基于表皮生长因子受体(epidermal growth factor receptor，EGFR)和K-ras基因检测的EGFR酪氨酸激酶抑制剂(tyrosine kinase inhibitor，TKI)靶向治疗为NSCLC患者带来了新的希望[1]。现已明确，K-ras基因是EGFR信号传导通路中重要的下游分子，其突变与肺癌患者对TKI的原发性耐药有关，而且97%的突变位点为外显子2的12和13位密码子[1]。因此K-ras突变是影响NSCLC患者TKI治疗效果及预后的关键因素[2]，检测K-ras突变是一个必要的治疗抉择。研究发现K-ras突变为肿瘤特异性的体细胞遗传改变，正常细胞中尚未发现[3]，但在癌症患者的血浆中，有少量的包含突变序列的游离DNA从原发或转移的肿瘤细胞释放入血，但由于浓度过低，很难在大量的野生型序列中将其检测出来，如传统的Sanger测序方法需要突变体DNA至少占到野生型DNA的10%～20%[4]。因此，提高突变DNA相对浓度，抽提并富集少量突变小片段DNA是技术的关键。在本研究中，我们建立了一种酶切富集突变DNA后行焦磷酸测序的方法，用于检测临床癌组织及血浆样本中的K-ras突变体。

1 资料与方法

1.1 临床资料 收集2013年1月－10月在重庆新桥医院全军肿瘤诊治研究所治疗的经组织学和(或)细胞学确诊的43例NSCLC患者的癌组织和外周血标本，所有患者TNM分期均为Ⅲ-Ⅳ期。

1.2 标本采集与DNA提取 ①患者入院后次日采集空腹外周静脉血2ml，EDTA抗凝，2h内分离血浆，采用QIAamp Mini Blood Kit提取血浆内游离DNA。②包括经皮肺穿刺和纤维支气管镜所取得的新鲜组织或4%甲醛浸泡或石蜡包埋的切片，采用QIAamp DNA FFPE Tissue Kit提取组织DNA，具体操作按说明书进行。超微量紫外分光光度计测定DNA浓度，记录编号，置于－20℃冰箱保存备用。

1.3 酶切富集PCR扩增 采用酶切富集PCR法扩增包含12与13号密码子在内的K-ras基因第2外显子。引物(表1)由上海英骏生物科技有限公司合成。

表1 酶切富集PCR扩增引物及焦磷酸测序引物Tab.1 The primer of mutant-enriched PCR and pyrosequencing

第一轮PCR反应体系为25μl。12密码子的PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性20s、58℃退火30s、72℃延伸20s，共30个循环；72℃延伸10min。13密码子的PCR扩增条件为：94℃预变性3min；前10个循环为94℃变性20s、54℃退火30s、72℃延伸20s，后25个循环为94℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸20s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

使用突变体特异的内切酶Bsto Ⅰ、Nar Ⅰ选择性地酶切第一轮PCR扩增产物中K-ras第2外显子的12、13密码子。相应孵育温度下孵育4h(12、13密码子的孵育温度分别为60℃、37℃)。

第二轮PCR反应体系为40μl。12、13密码子的PCR扩增条件为：94℃预变性3min；94℃变性20s、60℃退火30s、72℃延伸20s，共50个循环；72℃延伸10min。根据K-ras突变情况将结果分为两组，即突变组和K-ras野生组。

1.4 焦磷酸测序 ①设定程序，分析序列为：GG/T/A/CTGG/A/C/TCGTAAGGCAAG；碱基分配序列为：TACGACTCAGATCGTAG。②在96孔PCR反应板中加入磁珠3μl、结合缓冲液37μl、PCR产物40μl，室温下1400r/min充分混匀5min。③配制含0.3μmol/L测序反应液45μl。④开启真空泵吸取磁珠和PCR产物混悬液，依次浸入70%乙醇、0.2mol/L NaOH和洗脱缓冲液中洗涤5s、5s、10s。关闭真空泵，将探头上吸附的磁珠释放入测序反应液，80℃孵育2min，使测序引物与模板退火杂交，然后室温下冷却10min。⑤根据程序计算得出剂量，在试剂仓中依次加入底物混合物、酶混合物以及4种dNTP，将试剂仓和96孔测序反应板放入机箱中开始反应[5]。

1.5 灵敏度鉴定 将K-ras基因突变型(12密码子)的A549细胞与K-ras基因野生型的HCC827细胞提取基因组DNA，使其中突变型与野生型K-ras基因的比例分别为1:0、0:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:5000。按上述检测12密码子突变的方法进行检测。

2 结 果

2.1 焦磷酸测序检测突变结果 43例癌组织中检测出4例突变，突变率为9.3%(4/43)，外周血样本中检测出3例突变，突变率为7.0%(3/43)。以癌组织中检测到的K-ras为标准，两者突变一致性达75.0%(3/4，表2)。两种标本同时存在突变的有3例，均为12密码子突变；A1、A2，D1、D2突变类型为GGT→AGT；B1，C1、C2突变类型为GGT→GAT；B2为野生型(图1)。

表2 NSCLC患者外周血和癌组织K-ras突变一致性Tab.2 Consistency of K-ras mutation from NSCLC patients'plasma and matched cancer tissue

2.2 灵敏度测试结果 K-ras突变型与野生型细胞分别按1:0、0:1、1:1、1:10、1:100、1:1000、1:5000比例混合(图2)，当突变型与野生型K-ras基因比例大于1:1000时(0.1%)时，即可见到突变的峰，表明检测阈值为0.1%(突变型/野生型基因)。

3 讨 论

ras基因家族中与人类肿瘤相关的基因有3种，即H-ras、K-ras、N-ras，其中K-ras与人类癌症关系最为密切，该基因位于人类染色体12p12.1，其编码的ras蛋白是细胞外信号向胞内传导的信号通路网络中的主要蛋白之一，可作为分子开关参与细胞增殖、分化、凋亡的调控。K-ras基因突变会导致ras蛋白异常活化，持续激活ras-raf-MEK等信号通路，导致细胞异常增生，促进肿瘤形成[6]。NSCLC患者K-ras突变主要发生于第2外显子的12、13密码子，其中12密码子的突变占87%，13密码子的突变占12%；第3外显子的61和146密码子的突变发生率低，只占K-ras突变的1%～4%。因此12、13密码子的基因突变状态越来越受到研究者们的重视。

图1 NSCLC患者外周血和癌组织K-ras突变焦磷酸测序检测结果Fig.1 K-ras mutations of NSCLC patients detected by pyrosequencing1. K-ras mutation in cancer tissue; 2. K-ras mutation in plasma. The black arrow showed the point mutation G→A in codon 12

图2 改良的酶切富集PCR-焦磷酸测序技术灵敏度测试结果Fig.2 The sensitivity of the modified mutant-enriched PCR combined with pyrosequencing The ratio of mutation type/wild type was 1:0(A), 0:1(B), 1:1(C), 1:10(D), 1:100(E), 1:1000(F) and 1:5000(G)

以往认为K-ras基因突变常常发生在肿瘤恶变的早期，原发灶和转移灶的K-ras基因保持高度一致[7]，且K-ras基因状态不会因治疗而发生变化[8]。然而目前已证实K-ras基因状态在转移进展过程中并不总是稳定的，在NSCLC患者的整个病程中，肿瘤细胞不断增殖分化，K-ras基因可能在转移过程中发生改变[9]。K-ras基因的转换状态可能是原发灶阴性而转移灶阳性，也可能原发灶阳性而转移灶阴性。即使只在一小部分细胞中检测到K-ras基因突变，仍然会给TKI治疗带来阻力。因此在同一患者不同时期，肿瘤对靶向治疗的适应性可能会有明显不同，建议在治疗过程中动态监测K-ras基因突变状况。

目前一般采用肿瘤组织DNA进行突变检测，常通过经皮肺穿刺、手术、纤维支气管镜等途径获得，但若动态监测组织来源的肿瘤细胞DNA突变状况，获取组织时创伤大，患者难以接受，对外周血进行检测具有创伤小、取材方便、可动态随访等特点，患者易于接受，但外周血中游离DNA量少，扩增少量突变DNA是技术上的关键。众多学者为解决这一难题，在PCR法的基础上探索出酶切富集PCR法，通过PCR扩增野生型或突变型DNA，限制性酶消化野生型基因，经消化后突变的比例相对于野生型DNA显著增加，然后再行第二轮PCR扩增突变的DNA序列。Maluf-Filho等[10]采用酶切富集PCR联合限制性片段长度多态性方法检测57例胰腺癌患者的癌组织，结果显示K-ras突变率为66.7%；Wu等[11]采用酶切富集PCR联合液态芯片分析技术检测109例非小细胞肺癌患者血清，结果显示K-ras基因突变率为31.2%；Yang等[12]采用酶切富集联合变性高效液相分析技术检测120例结直肠癌患者血浆，结果显示K-ras基因总突变率为38.3%。但这些方法分别需要应用电泳、设计镀探针的磁珠等，成本高、操作繁琐、结果主观性强。基于上述考虑，本研究探索了在酶切富集PCR的基础上，联合焦磷酸测序技术对PCR产物的突变类型进行分析。焦磷酸测序是一种新的DNA序列分析技术，其特点是操作简便、高通量、自动化，适合大样本的快速检测，但缺点为需已知突变位点，据突变位点选择特异的限制性内切酶。

本研究中，癌组织中K-ras基因突变率为9.3%，与文献报道的肺癌K-ras突变率10%～30%相比稍偏低[12]，考虑可能是样本量相对较少所致。本研究的43例癌组织样本中，4例为12密码子突变，突变类型为GAT、AGT；外周血样本中，3例为12密码子突变，突变类型与癌组织一致，1例经重复检测仍未检测到突变，原因可能为：①癌细胞在转移过程中丢失了某种K-ras基因型；②癌细胞群中存在广泛的表观遗传学及细胞遗传学，或是具有特定的器官转移亲嗜性[13]。本实验的灵敏度为0.1%，是直接测序法的100倍。本技术更适合临床检测血浆和组织样本中少量突变的K-ras基因，可用于活检和循环肿瘤细胞样本的检测。

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